短期頸動脈壓力感受器電刺激減輕犬心肌缺血再灌注損傷的機制研究

陽 康，廖 凱，薩仁高娃，黃 兵，陳彩云，魯志兵，何文博，王松云，江 洪

(武漢大學人民醫院心內科，湖北 武漢 430060)

短期頸動脈壓力感受器電刺激減輕犬心肌缺血再灌注損傷的機制研究

陽 康，廖 凱，薩仁高娃，黃 兵，陳彩云，魯志兵，何文博，王松云，江 洪

(武漢大學人民醫院心內科，湖北 武漢 430060)

目的 驗證短期頸動脈壓力感受器電刺激(Carotid baroreceptors stimulation，CBS）是否通過激活迷走神經的膽堿能抗炎通路減輕犬心肌缺血再灌注損傷。方法36只成年雜種犬隨機分為三組(n=12)：缺血再灌注組(I/R組)、頸動脈壓力感受器刺激組(CBS組)和迷走神經干切除術(Vagotomy)組(VAG組)。各個組別的實驗犬分別結扎左冠脈前降支1 h和再灌注6 h完成心肌缺血再灌注損傷模型。CBS組在心肌缺血前2 h對右側頸動脈竇開始進行高頻電刺激，直到實驗結束，刺激參數：頻率50 Hz，脈寬0.5 ms，刺激強度隨血壓進行調整，以保持血壓較刺激前下降10%。VAG組在頸動脈竇刺激前實施雙側頸迷走神經干切除術。于缺血前、缺血15 min、30 min、60 min和再灌注0.5 h、2 h、6 h時記錄心率(HR)和平均動脈壓(MAP)。各組隨機抽取6只犬于再灌注6 h后分別經頸內靜脈采血，采用ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-6濃度。采血后，迅速取出缺血區心肌組織，檢測髓過氧化物酶(MPO)活性觀察中性粒細胞浸潤情況。各組剩余6只犬于再灌注6 h后采用依文斯蘭—氯化三苯基氮唑(TTC)雙染色法檢測心肌缺血和心肌梗死面積。結果與I/R組比較，CBS組心肌梗死面積，MPO活性，血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量降低(P＜0.05)；與I/R組比較，VAG組心肌梗死面積，MPO活性，血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量差異無統計學意義(P＞0.05)。結論短期頸動脈壓力感受器電刺激可減輕犬心肌缺血再灌注損傷，抑制中心粒細胞向缺血組織浸潤以及抑制全身炎癥反應，其機制與短期頸動脈壓力感受器電刺激激活迷走神經的膽堿能抗炎通路有關。

頸動脈壓力感受器電刺激；心肌缺血再灌注損傷；炎癥反應；膽堿能抗炎通路；迷走神經

在全世界范圍內每年有500 000人死于心肌梗死[1]。經皮冠狀動脈介入治療和溶栓治療可及時再通閉塞血管，減少心肌梗死的范圍，是目前治療急性心梗最有效的方法。但是再灌注治療本身也可以導致心肌損傷，即心肌缺血再灌注損傷。高達50%的最終心肌梗死面積歸因于心肌I/R損傷[2]。研究表明，再灌注后炎癥反應是心肌I/R損傷重要致病因素之一，抑制炎癥反應可以明顯減輕心肌I/R損傷[3-4]。近年來，利用CBS治療心血管疾病是研究的熱點領域。長期CBS不僅安全有效，還可以治療頑固性高血壓和心力衰竭[5-9]。CBS可以抑制交感神經活性，提高迷走神經活性[10]?，F已證明，激活迷走神經后能夠通過膽堿能抗炎通路(Cholinergic anti-inflammatory pathway，CAP)而實現對炎癥反應的調控[11]。筆者之前的研究發現短期CBS可抑制中心粒細胞向缺血組織浸潤以及抑制全身的炎癥反應，從而減輕犬心肌缺血再灌注損傷[12]。因此，筆者推測CBS減輕犬心肌缺血再灌注損傷，其機制與激活迷走神經的膽堿能抗炎通路有關。

1 材料與方法

1.1 實驗分組及處理 健康成年雜種犬36只，體重14～22 kg，均為雄性，由武漢大學人民醫院動物中心提供。戊巴比妥鈉30 mg/kg前肢靜脈麻醉，以后每小時追加2 mg/kg維持麻醉狀態。氣管插管接動物呼吸機，分離一側股、動靜脈置入6F鞘管，動脈通道連接壓力換能器監測血壓，靜脈通道用于滴注生理鹽水補液。頸部脫毛備皮消毒后，在左側鎖骨上水平暴露左側頸內靜脈備采血標本。空調室溫控制在25℃～30℃，整個實驗過程中，犬下方放置電熱板以維持犬正常體溫。持續記錄體表心電圖(LEAD2000)。將實驗動物36只犬隨機分為三組，每組12只：(1)I/R組：首先，暴露雙側頸部皮膚，沿下顎骨正下方氣管旁切開皮膚，鈍性分離出兩側頸迷走神經干。右頸動脈竇位于右頸總動脈和頸內動脈分叉處的膨大組織。然后，暴露右頸動脈竇，用一小片封口膜隔離周圍組織。將一個特制的銀-氯化銀刺激電極圍繞頸動脈竇植入，并連接到脈沖發生器(SEN-7103，日本光電，日本東京)。在3～5 min內預先刺激3～4次確認血壓和心率明顯下降，然后再妥善安置電極。頸動脈竇的刺激參數為：頻率50 Hz，脈寬0.5 ms，刺激強度為引起血壓下降10%的電壓強度(3～7 V)[13]。最后，經左側第4肋間開胸，剪開心包，暴露心臟。于冠狀動脈左前降支第對角支、第二對角支之間穿針引線(2-0號無創絲線)，連同一小段硬質圓鈍頭的塑料管一起結扎，造成缺血，及時記錄心電圖的改變。結扎成功的標準：心肌缺血區局部發紺，同步Ⅱ導聯ECG顯示ST段明顯抬高，缺血期間出現室性心律失常。結扎1 h后，在硬質塑料管上切斷結扎線，恢復冠脈血流再灌注6 h。再灌注成功的標準：缺血區局部顏色變紅，同步Ⅱ導聯ECG顯示ST段逐漸恢復到缺血前水平，并出現再灌注室性心律失常。(2)CBS組：結扎冠脈前先開啟刺激儀，預刺激頸動脈竇2 h，直至再灌注6 h。(3)VAG組：開啟刺激儀前先切斷雙側頸迷走神經干，然后刺激頸動脈竇2 h，直至再灌注6 h。實驗流程見圖1。

圖1 實驗流程示意圖

1.2 血流動力學監測 在實驗全程中，采用LEDE2000多導電生理儀連續監測犬的HR、動脈收縮壓，舒張壓、MAP和II導聯心電圖。記錄心肌缺血前的HR和MAP，將該數值作為基礎值。然后記錄缺血15 min、30 min、60 min和再灌注0.5 h、2 h、6 h的HR和MAP。

1.3 血清炎癥因子和心肌MPO活性檢測 各組隨機抽取6只犬，于再灌注6 h后經頸內靜脈采血，采用ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-6的濃度。具體操作步驟完全按照試劑盒說明書進行。采血結束后處死動物，迅速取缺血區心肌組織，并用生理鹽水沖洗干凈。采用分光光度法測定髓過氧化物酶(MPO)活性，試劑盒均由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.4 心肌梗死面積的測定 各組剩下的6只犬，于再灌注6 h后處死動物，立即取下心臟，用生理鹽水沖洗干凈。采用依文斯蘭-TTC雙染色法測定心肌梗死面積。正常非缺血區染為藍色，梗死區(AN)呈灰白色，缺血非梗死區呈磚紅色，缺血心肌面積(AAR)為灰白色和磚紅色之和。對獲得的數碼相片采用Photoshop CS3 Extended軟件(Adobe公司，美國)進行測量處理，分別計算各部分的面積。缺血范圍用AAR與左室面積之比表示，梗死范圍以AN與AAR之比表示。

1.5 統計學方法 所有計量資料首先進行正態分布檢驗，符合正態分布的計量資料采用均數±標準差(±s)表示。應用SPASS17.0統計軟件對實驗數據進行分析。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較應用q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組犬血流動力學檢測結果比較 與I/R組比較，CBS組的HR、MAP差異無統計學意義，VAG組大多數時間段的HR、MAP要高于I/R組和CBS組，見表1。

2.2 各組犬再灌注6 h時血清炎癥因子濃度比較 I/R組和VAG組心肌再灌注6 h時血清TNF-α、IL-1β和IL-6濃度差異無統計學意義(P均＞0.05)。CBS組心肌再灌注6 h時血清TNF-α、IL-1α和IL-6濃度均顯著低于I/R組和VAG組(P＜0.05)，見表2。

表1 各組犬缺血期和再灌注期血流動力學指標(±s)

表1 各組犬缺血期和再灌注期血流動力學指標(±s)

注：與I/R組比較，aP＜0.05；與CBS組比較，bP＜0.05，1 mmHg=0.133 kPa。

項目HR(次min) MAP (mmHg)組別I/R組CBS組VAG組I/R組CBS組VAG組基礎值130±12 126±10 134±10b101±7 96±9 105±8b缺血15 min 125±10 123±5 128±7 103±5 98±12 106±7b缺血30 min 127±8 128±12 134±8ab105±12 97±10a107±8b缺血60 min 128±13 120±13 136±5ab99±10 99±8 104±7再灌注0.5 h 127±15 125±9 130±10 98±8 101±2 107±5a再灌注2 h 126±7 128±12 137±5ab104±3 97±15 107±10b再灌注6 h 129±8 130±7 134±10 101±10 98±10 105±12b

表2 各組犬再灌注6h時血清炎癥因子濃度比較(n=6，±s)

表2 各組犬再灌注6h時血清炎癥因子濃度比較(n=6，±s)

注：與I/R組比較，aP＜0.05;與CBS組比較，bP＜0.05。

組別I/R組CBS組VAG組IL-6(ng/L) 190.24±20.67 100.54±10.14a185.69±8.43bTNF-α(ng/L) 175.24±5.12 120.29±4.28a170.36±6.14bIL-1β(ng/L) 200.13±20.56 153.47±12.68a195.46±8.67b

2.3 各組犬心肌缺血區中性粒細胞浸潤情況比較 I/R組和VAG組可觀察大量密集的中性粒細胞浸潤到心肌缺血區。CBS組心肌缺血區可見中性粒細胞的浸潤程度顯著下降。I/R組和VAG組MPO活性差異無統計學意義[(20.14±3.27)vs(20.78±2.56)，P＞0.05]。CBS組的MPO活性顯著低于I/R組和VAG組[(13.26±4.17)vs(20.14±3.27)，13.26±4.17)vs (20.78±2.56)，P均＜0.05]。

2.4 各組犬心肌梗死面積檢測結果比較 I/R組和VAG組心肌梗死面積和缺血面積無統計學意義(P均＞0.05)。CBS組心肌梗死面積和缺血面積顯著低于I/R組和VAG組(P均＜0.05)，見表3。

表3 各組犬心肌梗死面積的檢測及比較結果(n=6，±s)

表3 各組犬心肌梗死面積的檢測及比較結果(n=6，±s)

注：與I/R組比較，aP＜0.05;與CBS組比較，bP＜0.05。

I/R組CBS組VAG組32.4±5.1 20.5±3.2a30.2±3.6b25.6±3.2 15.4±3.6a23.4±2.7b

3 討 論

在本研究中筆者發現，CBS可以明顯抑制缺血再灌注后中性粒細胞向缺血組織浸潤，抑制全身炎癥因子的釋放，減輕缺血再灌注引起的組織損傷。但是，當切除雙側頸迷走神經干，CBS不能發揮所有上述的保護心肌的作用。這證實了筆者的推測，即CBS能夠減輕犬心肌缺血再灌注損傷，其機制與激活迷走神經的膽堿能抗炎通路有關。

電刺激頸動脈壓力感受器可通過頸動脈竇動脈壓力感受性反射的傳入神經使到達孤束核的神經沖動增多，然后通過延髓內的神經通路，使頭端延髓腹外側區(RVLM)的血管運動神經元抑制，減弱交感神經緊張性活動，增強迷走神經緊張性活動，其效應為心率減慢，心輸出量減少，外周阻力降低，動脈血壓下降。研究表明，慢性CBS可以明顯抑制血管、心臟、腎臟的交感神經活性，同時提高迷走神經活性，從而起到長期降低血壓的作用[14]。迷走神經刺激可治療以過度和失調炎癥反應為特征的多種疾病，包括敗血癥、內毒素血癥、膿毒血癥、失血性休克、風濕性關節炎、心肌炎等[11]。Katare等[15]和Calvillo等[16]分別證實迷走神經刺激能夠減輕心肌I/R損傷，降低心肌梗死面積，且該保護作用不受降低心率的效果的影響。同迷走神經刺激具有保護心肌I/R損傷作用一樣，我們的研究發現CBS可以激活迷走神經活性，從而發揮同樣的效果。

心肌缺血再灌注后補體活化和活性氧自由基釋放等導致炎性細胞向心肌組織浸潤，并釋放大量促炎因子，如TNF-α、IL-1、IL-6等[17]；TNF-α和IL-6等可激活NF-кB，活化的NF-кB可進一步誘導大量促炎細胞因子釋放，包括TNF-α、IL-1、IL-6等[18]，進而減弱心肌微循環血管的通透性和破壞冠狀動脈微循環中的血流儲備，加重心肌損傷[19]。研究表明，迷走神經刺激可釋放乙酰膽堿特異性結合于組織巨噬細胞表面的含α7亞基的煙堿受體(α-7nACh)，抑制炎癥炎癥反應，即迷走神經-膽堿能抗炎通路[20]。Uemura等[21]發現在兔心肌缺血1 h再管注24 h后，短期的迷走神經刺激可抑制中性粒細胞向心肌組織的浸潤，減輕缺血區中性心肌組織中性粒細胞密度，抑制心肌組織炎癥因子的表達，如IL-1α、IL-6等。Yoshikawa等[22]證實乙酰膽堿活化α-7nAChR抑制NF-kB從細胞質轉向細胞核，從而減少IL-6和TNF-α等炎癥因子的表達。Wang等[23]發現迷走神經電刺激可以降低缺血再灌注心肌缺血區和非缺血區炎癥因子的釋放，包括NF-кB、IL-1、IL-6、HMCB-1和ICAM-1等，改善全身炎癥反應，減輕心肌心肌I/R損傷。本研究發現CBS能夠抑制心肌組織中性粒細胞的侵潤，在全身水平上減少促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的濃度，表明CBS同迷走神經刺激一樣具有明顯的抗炎作用。

本研究的不足之處在于我們并沒有應用α-7nACh抗體阻斷乙酰膽堿與α-7nACh的結合，從而在分子水平上阻斷膽堿能抗炎通路。由于缺乏α-7nACh抗體，且傳入迷走神經是膽堿能抗炎通路的首站，所以我們選擇切段雙側迷走神經干來阻斷膽堿能抗炎通路。其次，既往研究證實迷走神經刺激對心肌I/R損傷的保護作用，其機制除了抑制心肌I/R損傷誘導的炎癥反應，還與抑制氧自由基的釋放[24]、抑制心肌去甲腎上腺素[25]和間質肌紅蛋白的釋放[26]以及抑制再灌注誘導的線粒體通透性轉換孔開放[16]等有關。那么，CBS對心肌I/R損傷的保護作用是否也涉及到這些機制？這有待我們進一步的研究。

綜上所述，短期頸動脈壓力感受器電刺激可減輕犬心肌缺血再灌注損傷，抑制中心粒細胞向缺血組織浸潤以及抑制全身的炎癥反應，其機制與短期頸動脈壓力感受器電刺激激活迷走神經的膽堿能抗炎通路有關。但要完全明確CBS的保護機制，還需深入研究。

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Short-term carotid baroreceptors stimulation attenuates myocardial ischemia reperfusion injury in dogs.

YANG Kang,LIAO Kai,SA Rengaowa,HUANG Bing,CHEN Cai-yun,LU Zhi-bing,HE Wen-bo,WANG Song-yun,JIANG Hong.Department of Cardiology,Renmin Hospitial of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo test whether carotid baroreceptors stimulation could reduce acute myocardial ischemia reperfusion injury(IRI)through the cholinergic anti-inflammatory pathway.MethodsThirty-six dogs were randomly allocated into three groups,each with 12 dogs:ischemia reperfusion group(I/R group),carotid baroreceptors stimulation group(CBS group)and vagotomy group(VAG group).Dogs were subjected to 1 h coronary artery occlusion followed by 6 h reperfusion alone(I/R group).Dogs in CBS group were treated with carotid baroreceptors stimulation 2 h before ischemia myocardial(with frequency of 50 Hz,pulse width of 0.5 ms,and intensity adjusted with blood pressure to keep the blood pressure 10%lower than before stimulation).Dogs in VAG group were treated with vagotomy and carotid baroreceptors stimulation.Heart rate(HR),mean arterial pressure(MAP)were recorded before ischemia,15 min,30 min,60 min after ischemia,0.5 h,2 h,6 h after reperfusion.Six dogs were selected in each group and collected for venous blood 6 h after reperfusion.Serum levels of inflammatory cytokines(TNF-α,IL-1β,IL-6)during re-perfusion were assayed,and the neutrophil infiltration(MPO activity)was quantified.The ischemia myocardial and infarct size were detected in the remaining 6 dogs in each group.ResultsCompared with I/R group,infarct size,MPO activity,serum levels of TNF-α,IL1-βand IL-6 in CBS group at 6 h after reperfusion were significantly lower(P＜0.05). However,there was no statistically significant difference between VAG group and I/R group.ConclusionCarotid baroreceptors stimulation attenuates myocardial ischemia reperfusion injury.The underlying mechanism may be associated with activating the cholinergic anti-inflammatory pathway.

Carotid baroreceptors stimulation;Myocardial ischemia reperfusion injury;Inflammatory reaction;Cholinergic anti-inflammatory pathway;Vagus nerve

R-332

A

1003—6350（2015）08—1101—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.08.0395

2014-10-24)

國家自然科學基金（編號：81270339、81170195、81300812)；湖北省自然科學基金（編號：2013CFB302）；武漢市科技攻關項目（編號：2013060602010271）；武漢大學青年教師自主科研項目（編號：2042012121087）；武漢大學2012年博士研究生自主科研項目（編號：2012302020206）

江 洪。E-mail：jianghong58@gmail.com