金雀異黃素抑制肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的特性及對(duì)氟尿嘧啶耐藥性的影響

李 翀，唐純娜，賀更生

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科，湖南 衡陽(yáng) 421001)

金雀異黃素抑制肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的特性及對(duì)氟尿嘧啶耐藥性的影響

李 翀，唐純娜，賀更生

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科，湖南 衡陽(yáng) 421001)

目的 研究金雀異黃素對(duì)SMMC-7721細(xì)胞系肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞特性以及氟尿嘧啶敏感性的影響。方法不同濃度金雀異黃素處理SMMC-7721細(xì)胞系球形成細(xì)胞。腫瘤球形成法檢測(cè)自我更新能力。MTT比色法測(cè)定氟尿嘧啶藥物敏感性。Western blot分析干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、CD44、Gli1和ABCG2蛋白表達(dá)。結(jié)果金雀異黃素顯著抑制SMMC-7721細(xì)胞腫瘤球形成，并優(yōu)先抑制球形成細(xì)胞增殖活性(P＜0.05)。金雀異黃素(10 μmol/L)有效逆轉(zhuǎn)球形成細(xì)胞對(duì)氟尿嘧啶的耐藥性。金雀異黃素降低CD133、CD44、Gli1和ABCG2蛋白表達(dá)水平。結(jié)論金雀異黃素抑制肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞特性和氟尿嘧啶耐藥性，其作用機(jī)制與抑制干細(xì)胞標(biāo)志物蛋白表達(dá)和阻斷Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。

肝細(xì)胞癌；腫瘤干細(xì)胞；金雀異黃素；多藥耐藥

金雀異黃素(4'，5，7-三羥基異黃酮)是大豆制品的主要異黃酮化合物。過去幾十年的實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)有力證明，金雀異黃素對(duì)多種癌細(xì)胞包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和肝癌細(xì)胞具有抑制作用[1]。已經(jīng)證明，金雀異黃素可以調(diào)節(jié)與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期有關(guān)的基因，有望成為一種抑制腫瘤發(fā)生的化學(xué)預(yù)防藥物[2]。此外，研究顯示金雀異黃素抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，展示其在抑制腫瘤發(fā)生和演進(jìn)方面的多效性[3]。迄今為止，金雀異黃素對(duì)癌癥抑制的作用機(jī)制并未完全闡明。

與大體腫瘤細(xì)胞不同，腫瘤干細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤組織中一小群干細(xì)胞樣特性的細(xì)胞，具有啟動(dòng)腫瘤生長(zhǎng)、自我更新和耐藥性的性質(zhì)，從而引起腫瘤復(fù)發(fā)[4]。因此，尋找一種抑制腫瘤干細(xì)胞自我更新和逆轉(zhuǎn)耐藥性的藥物，可能為癌癥的治療提供一種新策略。本文主要研究金雀異黃素對(duì)SMMC-7721細(xì)胞系肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞特性以及氟尿嘧啶敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與試劑 肝癌細(xì)胞系SMMC-7721從上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(中國(guó)上海市)購(gòu)得。SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)在添有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。金雀異黃素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，MTT購(gòu)自Sigma公司。胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。胰蛋白酶和二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Amersco公司。

1.2 腫瘤球形成法 參照文獻(xiàn)[4]描述的方法，用無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基[含20 ng/ml表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子EGF，Peprotech)、10 ng/ml重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF，Peprotech)、1XB27(Invitrogen)和0.4 μg/ml胰島素(Peprotech)]的DMEM/F12(Invitrogen)培養(yǎng)基懸浮肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞系細(xì)胞，5 000細(xì)胞/孔的密度接種6孔超低粘附培養(yǎng)板(BD公司)。培養(yǎng)6 d，在顯微鏡下可見腫瘤球形成細(xì)胞(SFCs)，胰蛋白酶-EDTA消化，并計(jì)數(shù)。

1.3 腫瘤球形成率測(cè)定與藥物處理 為了測(cè)定腫瘤球形成率，細(xì)胞以1 000個(gè)/孔的密度接種于24孔超低粘附培養(yǎng)板(BD公司)。培養(yǎng)6 d，計(jì)數(shù)腫瘤球數(shù)。腫瘤球形成率=每孔腫瘤球均數(shù)/每孔接種活細(xì)胞數(shù)(1000)×100%。為了分析金雀異黃素對(duì)SMMC-7721球形成細(xì)胞自我更新的影響，加入含金雀異黃素(10μmol/L)的干細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)基。

1.4 藥物敏感性試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[5]描述的方法，應(yīng)用MTT(Cell titer 96?Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay，Promega，Beijing，China)法測(cè)定細(xì)胞對(duì)藥物的耐藥指數(shù)。SMMC-7721細(xì)胞系細(xì)胞或球形成細(xì)胞(2×103/孔)接種于96孔板。存在或不存在金雀異黃素(10 μmol/L)處理24 h，用圖2標(biāo)示濃度氟尿嘧啶處理。72 h后，用自動(dòng)化酶標(biāo)儀(Bio-Rad 550)在550 nm處測(cè)定吸光度。相對(duì)細(xì)胞活性以百分率表示。

1.5 Western blot分析 參照文獻(xiàn)[6]完成Western Blot分析。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光儀(Amersham Biosciences)檢測(cè)信號(hào)。一抗包括：抗Gli1(美國(guó)Cell Signaling公司)、抗ABCG2(美國(guó)Millipore公司)、抗CD133(德國(guó)Miltenyi公司)、抗CD44抗體(美國(guó)Cell signaling公司)、鼠抗人β-catenin單克隆抗體和辣根過氧化物酶-結(jié)合的羊抗鼠二抗(美國(guó)Santa Cruz生物科技有限公司)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)表示為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)。應(yīng)用Windows軟件系統(tǒng)(SPSS Inc，Chicago，IL)的SPSS 13.0對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。Student'st-檢驗(yàn)用于比較各組間的差異。雙側(cè)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金雀異黃素抑制人肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞系腫瘤球形成能力 腫瘤球形成法檢測(cè)結(jié)果表明，干細(xì)胞條件培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)人肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞系細(xì)胞能形成腫瘤球(圖1A)。SMMC-7721球形成細(xì)胞傳代培養(yǎng)結(jié)果顯示：第3代球形成細(xì)胞的腫瘤球形成率最高(圖1B)，稱為肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞。金雀異黃素(10 μmol/L)孵育72 h顯著降低SMMC-7721細(xì)胞系細(xì)胞和肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的胞腫瘤球形成率(圖1C、1D)。

2.2 金雀異黃素逆轉(zhuǎn)肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞氟尿嘧啶(5-FU)耐藥性 MTT比色測(cè)定的結(jié)果證明，肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞耐受常規(guī)化療藥物氟尿嘧啶細(xì)胞毒作用，金雀異黃素(10 μmol/L)預(yù)孵育能有效降低氟尿嘧啶的化療耐藥性，見圖2。

2.3 金雀異黃素下調(diào)肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)志物蛋白表達(dá) Western blot分析結(jié)果證實(shí)：與人肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞系細(xì)胞比較，肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物CD133和CD44蛋白；金雀異黃素(10 μmol/L)作用24 h顯著降低肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞CD133和CD44蛋白表達(dá)水平，見圖3。

圖1 金雀異黃素對(duì)SMMC-7721細(xì)胞系細(xì)胞(原代)和球形成細(xì)胞(第3代)腫瘤球形成率的影響

圖2 金雀異黃素對(duì)SMMC-7721球形成細(xì)胞氟尿嘧啶敏感性的影響

圖3 金雀異黃素對(duì)SMMC-7721球形成細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)志物蛋白表達(dá)的影響

2.4 金雀異黃素抑制Gli1和ABCG2蛋白表達(dá) Western blot分析結(jié)果證實(shí)：與人肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞系細(xì)胞相比，肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞高表達(dá)Gli1和ABCG2蛋白，見圖4；金雀異黃素(10 μmol/L)作用24 h明顯下調(diào)肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞Gli1和ABCG2蛋白表達(dá)。

圖4 金雀異黃素對(duì)SMMC-7721球形成細(xì)胞Gli1和ABCG2蛋白表達(dá)的影響

3 討論

金雀異黃素是大豆制品中的主要異黃酮化合物，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其具有抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。腫瘤干細(xì)胞學(xué)說認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞是導(dǎo)致腫瘤患者復(fù)發(fā)的主要原因[7]。筆者推測(cè)，金雀異黃素抑制腫瘤干細(xì)胞特性可能是預(yù)防腫瘤發(fā)生的潛在機(jī)制。在我們的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型中SMMC-7721球形成細(xì)胞高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物CD133和CD44蛋白。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，金雀異黃素抑制SMMC-7721球形成細(xì)胞自我更新能力。與其抑制效應(yīng)一致，金雀異黃素下調(diào)SMMC-7721球形成細(xì)胞CD133和CD44表達(dá)。

腫瘤干細(xì)胞的另一個(gè)特性是化療耐藥性[8]。我們的結(jié)果顯示，金雀異黃素增強(qiáng)SMMC-7721球形成細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶和順鉑的化療敏感性。化療敏感性與ABCG2有關(guān)。金雀異黃素抑制ABCG2蛋白表達(dá)。同時(shí)，金雀異黃素抑制腫瘤球形成。我們的結(jié)果與其他報(bào)道相一致，ABCG2不僅僅在多藥耐藥中發(fā)揮主要作用，而且也是腫瘤干細(xì)胞特征性標(biāo)記物[9]。

Hedgehog(Hh)信號(hào)傳導(dǎo)在哺乳動(dòng)物發(fā)育和干細(xì)胞維持中具有重要作用[10]。Hh通路的活化從通過Hh配體結(jié)合其細(xì)胞表面受體Patched(Ptc)開始，然后，導(dǎo)致效應(yīng)蛋白、G蛋白耦聯(lián)受體和Smoothened(Smo)抑制的解除[10]。最后，Smo活化Gli家族轉(zhuǎn)錄因子及其靶基因。Hh/Gli信號(hào)失調(diào)涉及到多種腫瘤發(fā)生和演進(jìn)，例如，Gli1基因在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤擴(kuò)增和基底細(xì)胞癌活化[11]。鼠Gli1的轉(zhuǎn)基因過表達(dá)導(dǎo)致基底細(xì)胞癌的發(fā)展[11]，已經(jīng)證實(shí)在肝細(xì)胞癌細(xì)胞和組織中存在Gli1活化[12]。最近的研究表明ATP-結(jié)合盒運(yùn)轉(zhuǎn)G家族蛋白成員2(ABCG2)是一個(gè)Hh/Gli信號(hào)的直接轉(zhuǎn)錄靶分子[13]。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，金雀異黃素處理導(dǎo)致Gli1蛋白表達(dá)下調(diào)。因此，筆者推測(cè)，金雀異黃素抑制肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞特性和氟尿嘧啶耐藥性，其作用機(jī)制與抑制干細(xì)胞標(biāo)志物蛋白表達(dá)和阻斷Hh信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。

[1]Banerjee S,Li Y,Wang Z,et al.Multi-targeted therapy of cancer by genistein[J].Cancer Lett,2008,269(2):226-242.

[2]Peterson G,Barnes S.Genistein inhibits both estrogen and growth factor-stimulated proliferation of human breast cancer cells[J].Cell Growth Differ,1996,7(10):1345-1351.

[3]Farina HG,Pomies M,Alonso DF,et al.Antitumor and antiangiogenic activity of soy isoflavone genistein in mouse models of melanoma and breast cancer[J].Oncol Rep,2006,16(4):885-891.

[4]Ren KQ,Cao XZ,Liu ZH,et al.8-bromo-5-hydroxy-7-methoxychrysin targeting for inhibition of the properties of liver cancer stem cells by modulation ofTwist signaling[J].Int J Oncol,2013,43(5):1719-1729.

[5]Huang W,Wan C,Luo Q,et al.Genistein-inhibited cancer stem cell-like properties and reduced chemoresistance of gastric cancer [J].Int J Mol Sci,2014,15(3):3432-3443.

[6]周 蓓,肖立紅,肖 蕎,等.8-溴-7-甲氧基白楊素對(duì)Huh-7細(xì)胞系肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞自我更新的影響[J].湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2013,3(1):10-14.

[7]Clarke MF,Dick JE,Dirks PB,et al.Cancer stem cells-Perspectives on current status and future directions:AACR Workshop on cancer stem cells[J].Cancer Res,2006,66(19):9339-9344.

[8]Soh SX,Lim JY,Huang JW,et al.Multi-agent chemotherapy overcomes glucocorticoid resistance conferred by a BIM deletion polymorphism in pediatric acute lymphoblastic leukemia[J].PLoS One, 2014,9(8):e103435.

[9]Liu J,Ma L,Xu J,et al.Co-expression of CD44and ABCG2 in spheroid body-forming cells of gastric cancer cell line MKN45[J]. Hepatogastroenterology,2013,60(125):975-980.

[10]Ingham PW,Nakano Y,Seger C.Mechanisms and functions of Hedgehog signalling across the metazoan[J].Nat Rev Genet,2011,12(6): 393-406.

[11]Nilsson M,Unden AB,Krause D,et al.Induction of basal cell carcinomas and trichoepitheliomas in mice overexpressing GLI-1[J]. Proc NatlAcad Sci USA,2000,97(7):3438-3443.

[12]Jeng KS,Sheen IS,Jeng WJ,et al.Activation of the sonic hedgehog signaling pathway occurs in the CD133positive cells of mouse liver cancer Hepa 1-6 cells[J].Onco Targets Ther,2013,6:1047-1055.

[13]Zhang S,Wang Y,Mao JH,et al.Inhibition of CK2αdown-regulates Hedgehog/Gli signaling leading to a reduction of a stem-like side population in human lung cancer cells[J].PLoS One,2012,7 (6):e38996.

Inhibition of genistein on characteristics of liver cancer stem-like cells and its effect on fluorouracil-resistance.

LI Chong,TANG Chun-na,HE Geng-sheng.Department of General Surgery,the First Affiliated Hospital,University of South China,Hengyang 421001,Hunan,CHINA

ObjectiveTo investigate the effects of genistein on the characteristics of liver cancer stem-like cells(LCSLCs)derived from SMMC-7721 cell line and the sensitivity to fluorouracil.MethodsSphere-forming cells(SFCs)from SMMC-7721 cell line were treated with various concentrations of genistein.The capability of self-renewal was tested using tumor sphere-forming assay.The sensitivity to fluorouracil was determined by MTT assay.And the protein expression of stem cell markers CD133,CD44,Hedgehog(Hh)signal effector Gli1 and its target molecule ABCG2 was analyzed using Western blot.ResultsGenistein significantly inhibited the capability of sphere-forming in SMMC-7721 SFCs and relative selectively suppressed the proliferation activity of SFCs(P＜0.05). Genistein(10 μ mol/L)could effectively reverse the resistance of SFCs to fluorouracil.And genistein could also down-regulate the protein expression of CD133,CD44,Gli1 and ABCG2.ConclusionGenistein inhibits characteristics of liver cancer stem cells and resistance to Fluorouracil,and its mechanism is likely involved in inhibiting protein expression of stem cell markers and obstructing Hh signal pathway.

Liver cancer;Cancer stem cells;Genistein;Multidrug resistance

R735.7

A

1003—6350（2015）08—1108—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.08.0397

2014-10-09)

賀更生。E-mail：gengshenghe@Yahoo.com.cn