血管生成抑制素治療血管瘤的研究

符策奕，張澤華，張愛聯，羅進賢

（1.海南省食品藥品檢驗所，海南 海口 570216；2.中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所，海南 海口 571101；3.中山大學，廣東 廣州 510275）

血管生成抑制素治療血管瘤的研究

符策奕1，張澤華2，張愛聯2，羅進賢3

（1.海南省食品藥品檢驗所，海南 海口 570216；2.中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所，海南 海口 571101；3.中山大學，廣東 廣州 510275）

目的 觀察血管生成抑制素治療血管瘤的效果。方法發酵畢赤酵母工程菌組成型表達重組血管生成抑制素，用SP-Sepharose Fast Flow(陽離子交換劑)柱進行蛋白純化；通過抑制雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成試驗和誘發血管內皮細胞凋亡試驗，分析重組血管生成抑制素的生物學活性，在血管瘤模型(公雞肉垂)中注射血管生成抑制素，分析血管生成抑制素對血管瘤的藥效。結果血管生成抑制素在畢赤酵母中高效表達，經過純化，收獲達98%的重組血管生成抑制素；重組血管生成抑制素具有抑制CAM血管生成和誘發血管內皮細胞凋亡的活性；重組血管生成抑制素與血管瘤模型作用14 d后，瘤體血管生長抑制率為51%(P＜0.01)，血管瘤增殖抑制率為39%(P＜0.05)。結論成功制備重組血管生成抑制素藥物，血管生成抑制素對于血管瘤模型具有顯著的藥效。

血管生成抑制素；治療；血管瘤；效果

血管瘤是以內皮細胞增生為特征的腫瘤，是新生兒的常見病與多發病[1]。血管瘤以體表多見，也常生長于體內臟器。血管瘤造成美容缺陷，也可導致功能障礙。血管瘤可有惡性進程特點，可出現諸多的并發癥，如潰爛、出血、感染等；生長在體內的血管瘤壓迫周圍組織，影響臟器功能，如眶內血管瘤影響視力[2]，縱隔或肺部血管瘤影響壓迫氣道，肝臟或腹腔多發血管瘤造成臟器受壓[3]。雖然，部分血管瘤可自行衰退，但是，由于存在著不能自行衰退的危險，不僅是那些對身體機能造成危害的血管瘤，即使是那些位于不可能產生功能損害的部位以及慢生長的血管瘤的患者的家長都會選擇治療血管瘤。雖然目前有多種治療血管瘤的措施，例如手術、冷凍、激光、放射、硬化劑、物理、激素等，但是仍存在著美容效果不理想、并發癥比例高、副作用大或是不適合于治療體內血管瘤等問題[1]，尚有待于尋找高效安全的治療血管瘤的藥物。

血管生成抑制因子是具有抑制血管內皮細胞增殖的蛋白質。血管生成抑制因子對血管的抑制作用特異性高，在抗人癌的臨床試驗證明不產生毒性和抗藥性[4]。而血管生成抑制素是一種重要的血管生成抑制因子，相當于纖溶酶原的K1-4功能區。前期的研究證明該蛋白具有抑制腫瘤血管增殖而達到抗癌的效果[5]。根據血管瘤的本質是毛細血管的異常增生，本文應用血管生成抑制素治療血管瘤，以探討其治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料 重組了血管生成抑制素基因的畢赤酵母工程菌由中山大學羅進賢教授實驗室提供(其工程菌的特征是用畢赤酵母的磷酸甘油醛脫氫酶啟動子調控基因，磷酸甘油醛脫氫酶啟動子是組成型強啟動子[6])。人纖溶酶原抗血清和G418為Sigma公司產品，二抗為上海生物制品研究所產品，陽離子交換SP-Sepharose Fast Flow為Sweden產品，公雞由海南省文昌養雞場提供，人臍帶靜脈細胞購自中山大學細胞中心。

1.2 方法

1.2.1 重組蛋白的表達 參照Invitrogen公司提供的實驗操作手冊[7]。

1.2.2 重組蛋白的純化 采用陽離子交換層析純化重組蛋白。根據蛋白的氨基酸序列分別計算其等電點，配制相應pH值的磷酸氫二鈉和檸檬酸溶液，用于SP-Sepharose Fast Flow陽離子交換柱的平衡和洗脫。洗脫分三個步驟進行，分別對應0.3 mol/L、0.6 mol/L和1 mol/L濃度的Na+離子交換。過柱之后的洗脫液進行SDS-PAGE確認目標蛋白是否被洗脫以及洗脫時所用Na+的濃度。蛋白純度分析參考文獻[8]。

1.2.3 抑制雞胚容貌尿囊膜血管生成試驗 參考文獻[8]的方法。

1.2.4 誘發血管內皮細胞凋亡試驗 參考文獻[8]的方法。

1.2.5 血管瘤模型中用藥 公雞肉垂是天然的血管瘤模型。將雄性2個月齡的10只公雞分為兩組，一組為實驗組，另一組為對照組，每組5只。在實驗組公雞的右側肉垂注射血管生成抑制素，其藥物用量為5μg/只肉垂，對照組公雞右側肉垂注射等體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)。每2 d用藥一次，共維持用藥2個星期。在用藥期間觀察記錄公雞的體重和肉垂的增殖。計算受試肉垂的生長抑制率。在用藥兩星期后切下其右側肉垂進行組織切片染色，計數組織切片中血管的數量。計算受試肉垂中血管減少率。

1.3 觀察指標與評價方法 本文采用肉垂增殖差異性、體重差異性和血管數量差異性等數據對藥物有效性進行評價，上述數據來源為每一只試驗動物試驗前后的肉垂增殖長度差值、體重差值和血管數量差值。血管瘤生長抑制率=(1-實驗組給藥前后平均血管瘤長度差/對照組給藥前后平均血管瘤模型長度差)×100%；血管增長抑制率=(1-實驗組血管瘤中血管平均數/對照組血管瘤中血管的平均數)×100%[9]。

1.4 統計學方法 采用SPSS Statistics 17.0數據處理軟件對測試數據進行分析。在分析兩組間的肉垂增殖差異性、體重差異性和血管數量差異性時均先進行正態性檢驗，并以均數±標準差(±s)的方式表示，再采用配對t檢驗對兩組的測試數據進行分析，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 重組血管生成抑制素 將構建的含血管生成抑制素基因的畢赤酵母工程菌接種于YPD培養基中，30℃振蕩培養，2 d后取樣，離心取上清液走蛋白電泳(SDS-PAGE)檢查基因表達情況，結果如圖1所示。由圖1可見，與畢赤酵母發酵液上清比較，工程菌的發酵液上清出現符合血管生成抑制素分子量的38 kD的新的蛋白帶。將經過重組蛋白純化的血管生成抑制素(純度達98%)進行蛋白印跡，蛋白印跡結果表明，這條新的蛋白帶能與人纖溶酶原抗血清特異結合，證明這條蛋白帶是重組血管生成抑制素。

圖1 畢赤酵母工程菌表達重組血管生成抑制素及其蛋白印跡分析

2.2 重組血管生成抑制素對血管內皮細胞及CAM血管的作用 如圖2所示，僅加bFGF的對照組的雞胚絨毛尿囊膜(CAM)的載樣濾紙下形成血管叢(平均116條血管)，而同時加bFGF和血管生成抑制素的雞胚CAM的載樣濾紙下則形成少血管區(平均17條血管)，t檢驗結果表明，實驗組與對照組的數量比較差異具有顯著統計學意義。血管內皮細胞凋亡結果如圖3所示。當血管生成抑制素與人臍靜脈細胞作用24 h，PBS組的血管內皮細胞凋亡率為3.5%，而血管生成抑制素組的血管內皮細胞凋亡率為82%。血管生成抑制素組的血管內皮細胞凋亡率極其顯著高于PBS組的凋亡率。以上實驗結果表明，在畢赤酵母中表達的血管生成抑制素具有誘發血管內皮細胞凋亡和抑制血管生成的作用。

圖2 重組血管生成抑制素抑制雞胚CAM血管生成

圖3 重組血管生成抑制素誘發血管內皮細胞凋亡

2.3 血管生成抑制素對血管瘤模型的藥效 主要考察血管瘤模型的增長情況，以及血管瘤模型中血管的數量。如表1所示，在兩周的治療時間里，血管生成抑制素實驗組的血管瘤模型增殖顯著慢于對照組(P＜0.05)，瘤模型增長抑制率為39%。如圖4和圖5所示，血管生成抑制素治療組的血管瘤模型中的血管數量極其明顯少于PBS對照組的血管數量(P＜0.01)，血管增殖抑制率為51%。表2為受試公雞實驗前后的體重變化，統計學分析結果表明兩組的體重增加差異無統計學意義。以上結果表明，血管生成抑制素具有抑制血管瘤的血管增殖以及抑制血管瘤發展的顯著效果。

表1 給藥前后血管瘤模型長度變化比較(±s，cm)

表1 給藥前后血管瘤模型長度變化比較(±s，cm)

實驗組對照組1.38±0.36 1.34±0.23 2.10±0.49 2.52±0.18 0.72±0.38 1.18±0.19 0.023

表2 受試公雞的體重變化比較(±s，g)

表2 受試公雞的體重變化比較(±s，g)

實驗組對照組350±47 420±48 625±73 745±60 275±31 325±47 0.103

圖4 受試公雞肉垂組織切片（40×）

圖5 實驗后血管瘤中的平均血管數量

3 討論

在荷瘤的機體中能檢測到血管生成抑制素，但是含量甚微，因此，重組表達是獲得血管生成抑制素的主要途徑。畢赤酵母是廣泛應用于表達外源蛋白的菌株，已經報道應用畢赤酵母的AOX1表達系統表達幾百種外源蛋白。其缺陷在于AOX1表達系統在調控外源蛋白表達時需要甲醇作為誘導劑，而甲醇是毒性易揮發物質。而后，在畢赤酵母中發現了GAP啟動子，GAP啟動子是組成型強啟動子。由于GAP啟動子不需要甲醇等毒性物質作為碳源，在重組藥物的制備中更為安全[6]。本文成功地實現用畢赤酵母的GAP啟動子調控表達血管生成抑制素，并經純化獲得純度高的血管生成抑制素蛋白，建立了安全高效的生產重組血管生成抑制素的方法。

研究血管生成抑制因子治療腫瘤已經有二十幾年的歷程，其作用機理是通過抑制腫瘤誘發的血管的增殖，切斷腫瘤的營養供給，通過餓死腫瘤而達到治療目的。可見，血管生成抑制因子對于腫瘤的作用是間接的，而血管瘤本身是由血管的異常增生而構成，血管生成抑制因子對于血管瘤的作用是直接的作用，直接作用的療效應該優于間接作用的療效。雞冠及肉垂的真皮內，尤其是其淺層內有許多管腔擴大了的毛細血管網。電鏡下可見連續性內皮及基膜，毛細血管之間有較多的成纖維細胞及膠原原纖維，這樣的雞冠結構與人的血管瘤十分類似，是良好的天然的血管瘤模型[10]。自從Ritter首次研究和應用來亨雞的雞冠和肉垂作為血管瘤模型進行治療研究以來[10]，國內外陸續有關于以公雞的雞冠和肉垂作為血管瘤模型而應用于血管瘤的治療研究[11-12]。應用公雞肉垂這一天然的血管瘤模型，本文研究血管生成抑制素對于血管瘤的治療作用，證明血管生成抑制素能夠通過抑制血管瘤中血管的增殖而抑制血管瘤的發展，并且對于機體的生長發育沒有影響，這些結果體現了血管生成抑制素具有開發作為安全高效的治療血管瘤藥物的前景。在接下來的研究中，我們將以與人同為靈長類的猴子為載體，將人的血管瘤移植于猴子，作為人的血管瘤模型，深入研究血管生成抑制素治療人血管瘤的效果。為開發血管生成抑制因子作為治療血管瘤藥物提供進一步的依據。

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Study on treating angeioma by angiostatin.

FU Ce-yi1,ZHANG Ze-hua2,ZHANG Ai-lian2,LUO Jin-xian3.1.Hainan Provincial Institute For Drug and Food Control,Haikou 570216,Hainan,CHINA;2.Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops,Ministry of Agriculture,Haikou 571101,Hainan,CHINA;3.Sun Yat-sen University,Guangzhou 510275, Guangdong,CHINA

Objective To observe the effect of using angiostatin to treat angeioma.MethodsRecombinant angiostatin was constitutively expressed in Pichia pastoris by fermentation and then purified by SP-Sepharose Fast Flow(cation exchanger).Biological activity of the recombinant angiostatin was analyzed by the tests of suppression angiogenesis of chorioallantoic membrane of chick embry(CAM)and inducing apoptosis of vascular endothelial cells.The drug effect for angeioma was analyzed after injecting recombinant angiostatin into the angeioma model (cock wattle).ResultsAngiostatin showed high-efficiency expression in Pichia pastoris and 98%of recombinant angiostatin had been obtained after the purification.The recombinant angiostatin had activity on suppressing of angiogenesis on CAM and inducing of vascular endothelial cells apoptosis.It's 51%(P＜0.01)of the inhibition rate of vascular growth in the angeioma model and 39%(P＜0.05)of the inhibition rate of proliferation of the hemangioma model after 14 days of maintenance therapy.ConclusionDrug of recombinant angiostatin had been successfully prepared.Angiostatin possesses prominent effect on the treatment of angeioma.

Angiostatin;Treatment;Angeioma;Effect

R732.2

A

1003—6350（2015）08—1111—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.08.0398

2014-10-24)

海南省重點科技計劃項目（編號：05204）

符策奕。E-mail：zhangailian6@163.com