miR-146a與類風濕關節炎患者疾病活動度的相關性研究

王楷文，邵 軍，劉 磊

(昆山市第一人民醫院中心實驗室1、超聲科2、風濕免疫科3，江蘇 昆山 215300)

miR-146a與類風濕關節炎患者疾病活動度的相關性研究

王楷文1，邵 軍2，劉 磊3

(昆山市第一人民醫院中心實驗室1、超聲科2、風濕免疫科3，江蘇 昆山 215300)

目的 通過檢測類風濕關節炎(RA)患者血漿中miR-146a的表達，探討miR-146a與疾病活動度的相關性。方法RA患者40例，其中活動期20例，非活動期20例，留取血漿提取和純化miRNA，實時定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測miR-146a的表達，采用SPSS13.0軟件進行統計學分析。結果活動期患者血液中炎性指標類風濕因子（RF)、C反應蛋白(CRP)、血沉（ESR)明顯增高；受累指關節滑膜增生厚度、miR-146a的表達明顯高于非活動期患者，差異有統計學意義(P＜0.05)；而兩組患者的抗CCP抗體、受累指關節滑膜血流分級與滑膜動脈阻力指數(RI)比較差異均無統計學意義(P＞0.05)。在RA活動期患者體內，miR-146a與滑膜增生厚度、血流分級、RF均有明顯的正相關(P＜0.05)；而與血液中其他一些炎癥指標(ESR、CRP、抗CCP)均無相關性(P＞0.05)。而非活動期患者的miR-146a與各項炎癥指數均無關聯(P＞0.05)。結論miR-146a在RA活動期患者血漿中高表達，且與反映RA患者病情活動度的一些特異性指標相關，而與其他一些非特異性指標無相關，提示血漿miR-146a可以作為RA患者疾病活動度的一個較特異性的預測指標。

類風濕關節炎；miRNA；疾病活動度

類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種最為常見的系統性自身免疫性疾病，主要是以慢性關節滑膜炎癥為特征，發病關節腔內充斥著淋巴細胞和巨噬細胞，其病理特征是關節滑膜及周圍結締組織異常增生，繼而滑膜內大量新生血管增生和廣泛慢性炎癥性細胞浸潤。滑膜組織表現為增生過度和凋亡受阻，其產生的基質金屬蛋白酶破壞關節囊內軟骨和骨，同時成纖維細胞增生促進關節纖維化。類風濕性關節炎在發病兩年內即可出現不可逆性骨關節破壞[1-3]。miRNA作為一種調控RNA，在維持正常的細胞周期、分化、凋亡、代謝等方面發揮著作用[4]。越來越多的證據[5]表明，miRNAs在維持免疫功能、穩定免疫系統等方面發揮著重要作用。表達異常的miRNAs可能與慢性炎癥、腫瘤及自身免疫性疾病等密切相關[6]。隨著高頻超聲技術的不斷發展，在早期診斷、評價類風濕關節炎的病程發展、判定病情活動度以及治療效果等方面都有重要的意義[7]。本研究旨在檢測RA患者血漿中miR-146a的表達，結合影像學、檢驗學診斷結果，分析其與RA患者病情活動度的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年7月至2013年7月在我院門診診治的類風濕關節炎累及手部小關節的患者40例為研究對象，其中女性32例，男性8例，年齡32～67歲，平均(49.5±17.5)歲，病程8個月至25年，平均12.4年。所有患者均符合1987年美國風濕病學會(ACR)修訂的RA診斷標準和分類標準。其中活動期患者20例，RA活動性評分系統(DAS28)≥4.0，血沉(ESR)(48±13)mm/h，C反應蛋白(CRP)(8.5±1.3)mg/dl，類風濕因子(RF)(517±37.5)IU/ml；非活動期患者20例，DSA28≤2.6，ESR(25±10)mm/h，CRP(2.2±1.9)mg/dl，RF(53.3±37.6)IU/ml。收集RA患者抗凝血5 ml，分離血漿1 ml。以上實驗室資料均來源于本院檢驗科報告單。

1.2 超聲儀器和檢測方法 采用GE Vivid 7、Toshiba Aplio XG，高頻線陣探頭頻率為5～12 MHz的彩色多普勒超聲診斷儀。血供情況采用彩色多普勒血成像和能量圖進行觀察。患者取仰臥位，雙手五指分開置于檢測臺，檢測患者雙手掌指關節(MCP1～5)的掌側和背側、近端指間關節(PIP1～5)外加尺側和橈側，每個側面均做橫切和縱切面的掃查。在垂直骨面最厚的地方測量滑膜組織的厚度。

1.3 指標判斷 (1)滑膜厚度：滑膜厚度正常，＜2 mm；輕度增生，2～5 mm；中度增生，5～9 mm；重度增生，＞9 mm。(2)血流供應：滑膜內無血流信號為0級；有1到2處點狀的血流信號為1級；有1條主血管，或者伴有2～3條小血管為2級；血流豐富，有4條以上，或者呈網狀為3級。

1.4 miR-146a的提取 用miRNeasy Mini Kit (QIAGEN公司)分離總RNA，取500 μl血漿樣本，加入700 μl QIAzol液，充分混勻后放置室溫5 min，加入140 μl酚氯仿，混勻15 s后放置室溫下2～3 min，離心15 min(12 000×g)，小心吸取上清液至新柱子管中，加入525 μl無水乙醇后混勻，離心30 s(12 000×g)。加入700 μl洗液，離心30 s(8 000×g)，后盡量將柱內液體甩干，后重復加入洗液500 μl洗滌兩遍(8 000×g，15 s)，完畢后加入50 μl洗液(8 000×g，1 min)，收集總RNA，用紫外分光光度計測定RNA濃度，以備后續使用。

1.5 miR-146a的反轉錄 用TaqMan?micro RNA逆轉錄試劑盒對提取的總RNA中的miRNA反轉錄成cDNA。按說明書將miRNA 5 μl加入反應體系中，反轉錄的反應條件：16℃30 min，42℃30 min，85℃5 min。反轉錄后產物用于后續實驗。

1.6 RT-PCR檢測miR-146a 取1μlcDNA，用miScript SYBR Green PCR Kit和miScript microRNA PCR Assay進行實時定量PCR。PCR反應體系20 μl，含cDNA 2 μl，2×Quantitect SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，PCR引物(miR-146a或U6的上下游引物) 4 μl，RNase-free water 4 μl，反應條件：95℃15 min，1個循環；94℃15 s，55℃30 s，70℃30 s 40個循環。在PCR儀(美國ABI公司)上進行實時熒光定量PCR，計算各標本平均Ct值，以小分子RNA U6作為內參，將miR-146a155的ct值減去U6 Ct值作為δCt值。計算標準化后的2-δCt值表示miRNA的相對表達含量。

1.7 統計學方法 采用SPSS13.0軟件包進行數據統計分析，計量數據以均數±標準差(±s)表示。RA患者活動期與非活動期兩組均數比較用獨立樣本t檢驗；RA滑膜厚度、血流級數與miRNA表達量進行Pearson相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-146a在RA兩組患者血漿中的表達 miR-146a在RA活動期患者血漿中的表達水平高于非活動期患者，差異有統計學意義(P＜0.05)，活動期患者血液中炎性指標(RF、CRP、ESR)明顯高于非活動期患者，差異均有統計學意義(P＜0.05)，但抗CCP差異無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 RA活動期與非活動期患者血漿中miR-146a的表達(±s)

表1 RA活動期與非活動期患者血漿中miR-146a的表達(±s)

活動期非活動期t值P值0.440±0.185 0.035±0.008 9.162 0.000 517±37.5 53.3±37.6 15.881 0.000 8.5±1.3 2.2±1.9 12.256 0.000 48±13 25±10 16.261 0.000 718±305.1 636.7±297.5-1.162 0.194

2.2 兩組RA患者受累指關節炎癥指數的變化 活動期患者滑膜增生厚度與非活動期患者比較明顯增厚，差異具有統計學意義(P＜0.05)，而滑膜血流分級與滑膜動脈RI在兩組患者中差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

2.3 miR-146a與RA患者指關節炎癥指數的相關性分析 RA活動期患者的miR-146a與滑膜增生厚度、血流分級均顯明顯的正相關(P＜0.05)，與RF也呈現明顯的正相關，而與血液中其他一些炎癥指標(ESR、CRP、抗CCP)均無明顯相關性(P＞0.05)。而在非活動期患者，miR-146a與各項炎癥指數均無關聯(P＜0.05)，見表3。

表2 活動期與非活動期RA患者指關節炎癥指數變化(±s)

表2 活動期與非活動期RA患者指關節炎癥指數變化(±s)

注：RI，阻力指數。

t值P值10.927 0.000 -2.689 0.349 -1.236 0.258

表3 活動期與非活動期RA患者miR-146a與指關節炎癥指數相關性分析(±s)

表3 活動期與非活動期RA患者miR-146a與指關節炎癥指數相關性分析(±s)

項目miR-146a(0.440±0.185)r值P值miR-146a(0.035±0.008)r值P值滑膜厚度3.45±0.58 0.539 0.000 2.61±0.28 0.298 0.359滑膜血流分級0.85±0.23 0.735 0.000 1.08±0.36 0.546 0.639滑膜動脈RI 0.53±0.12 0.457 0.603 0.66±0.25 0.423 0.591 RF(IU/ml) 517±37.5 0.758 0.000 53.3±37.6 0.175 0.679 CRP(mg/dl) 8.5±1.3 0.398 0.427 2.2±1.9 0.383 0.453 ESR(mm/h) 48±13 0.257 0.339 25±10 0.253 0.312抗CCP(Ru/dl) 718±305.1 0.023 0.970 636.7±297.5 0.035 0.800

3 討論

miR-146家族主要包括miR-146a和miR-146b兩個基因，兩個基因分別位于人第5、10號染色體，兩者的成熟序列僅相差2個堿基，這兩個miRNA在有些細胞中功能相近，但miR-146a僅在Treg細胞中高度表達[8]。Groh等[6]研究發現miR-146a對于維持正常的細胞免疫調節功能發揮著至關重要的作用。miR-146a的缺失可致細胞中的免疫失衡，主要表現為IFN-γ介導的多器官損害。miR-146a的缺失直接導致其靶基因STAT-1表達增加，而STAT-1增加又可選擇性清除IFN-γ受體下游基因SOCS1，從而導致細胞免疫功能異常。適當的miR-146a表達對于Th1細胞的反應及相關自身免疫性疾病起重要作用，其中，類風濕性關節炎作為一種典型的Th1細胞的反應及相關自身免疫性疾病，自然受到了眾多miRNAs研究學者的關注。

Filiponicz等[9]研究發現，在類風濕關節炎患者和骨關節炎患者的滑膜成纖維細胞(RASFs)中，miRNA-146a在RA的表達水平顯著高于對照組骨關節炎的患者。通過向體外RASFs培養基中添加一系列炎癥因子(IL-1、LPS、TNF-α)模擬RA的炎性環境，結果顯示，LPS和IL-1均可誘導miR-146a產生。由此椎斷，miR-146a水平增高與疾病引發的炎癥反應相伴隨。Friedman等[10]研究發現，miRNA-146a在RA患者外周血單核細胞中的表達水平升高，達到對照組的1.8倍，TRAF6和IRAK-l的表達水平在實驗組和對照組之間幾乎無明顯變化，作為miRNA-146a的兩個重要的靶分子是TNF-α通路重要的信號分子，miRNA-146a對于TNF-α的調控表達至關重要。RA患者體內表達上調的miRNA-146a卻不能抑制TRAF6和IRAK-l這兩個靶分子的水平，由此推測，RA患者體內miRNA-146a功能缺陷是導致TNF-α在患者體內持續表達的重要原因，同時也證實miRNA-146a與疾病炎癥的程度、疾病的活動性息息相關。

本研究結果顯示miR-146a在RA活動期患者血漿中的表達水平明顯高于非活動期，差異有統計學意義(P＜0.05)，與上述學者研究結果一致。研究表明，RA活動期患者受累關節超聲下表現為一些低回聲區，與滑膜囊積液之間有較為清楚的界限，為滑膜增生所致[11]，與本實驗所得出的結論(RA活動期患者滑膜增生厚度明顯高于非活動期患者)是一致的。血管內異常血流信號是RA的特征性改變，尤其在RA活動期，滑膜內新生血管過渡增生，血流灌注明顯增多，而靜止期RA患者血管內血流量明顯減少[12]。RI值可反映舒張期血流，在RA中可作為一個病情嚴重的檢測指標，活動期血管翳增多，RI值減少，反之亦然[12]。本實驗中所得出的結論顯示滑膜血流分級在兩組患者之間差異無統計學意義(P＞0.05)，與目前公認結果不相符，考慮為一些活動期患者經過藥物治療后，滑膜組織進入休眠期或纖維化，滑膜內血流減少，但滑膜厚度尚未明顯變薄。

本研究結果還顯示RA活動期患者血漿中miR-146a的表達水平與滑膜增生厚度、滑膜血流分級呈現明顯的正相關關系(P＜0.05)，與滑膜動脈RI卻無相應的相關關系(P＞0.05)，可能是由于滑膜動脈RI值僅限于色多普勒顯像中能顯示出，活動期患者滑膜處于過度增生的狀態，人為準確測出RI值困難，導致獲值樣本量過少，影響實驗結果。本實驗結果還顯示：miR-146a與RA相對特異性因子RF呈現正相關關系(P＜0.05)，與RA特異性指標(抗CCP抗體)卻無關聯。抗CCP抗體是RA早期診斷的特異性指標，而RF可作為疾病損傷嚴重性的較好的標記物，此觀點結合我們所收集的病例都已出現關節破壞的特征，可以解釋miR-146a與RF有相關性這一結果。我們還證實：活動期RA患者miR-146a與血液中一些非特異性炎癥相關因子(ESR、CRP)無相關關系，可能是由于活動期患者樣本量過少所致，也可能患者的治療藥物對miR-146a的表達影響較小，導致三者變化不一致。上述所有指標在非活動期患者體內均無得到與miR-146a明顯相關證據(P＞0.05)，說明miR-146a在RA穩定期缺乏較高的臨床價值。

綜上所述，血漿miR-146a不僅可以作為相對特異診斷RA的生物標志物、還可以作為RA病情活動度的預測指標，為RA的療效觀察及預后評估提供重要的依據。本實驗有待于進一步完善實驗數據，研究分析血漿miR-146a與其他受累關節(膝關節、腕關節等)病情活動度的關系，以更進一步確定其在RA中的價值。

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Correlation analysis between miR-146a and disease activity degree in patients with rheumatoid arthritis.

WANG Kai-wen1,SHAO Jun2,LIU Lei3.Central Laboratory1,Department of Ultrasonography2,Department of Rheumatology3,the First People's Hospital of Kunshan,Kunshan 215300,Jiangsu,CHINA

Objective To explore the expression of miR-146a in patients with rheumatoid arthritis(RA),and to analyze the correlation between miR-146a and disease activity degree.MethodsPlasma were separated from the peripheral blood of 40 RA patients(20 of active stage and 20 of inactive stage).Total RNAs were isolated and microRNA(miRNAs)were purified.The levels of miR-146a were determined by quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR).Statistical data were analyzed using SPSS13.0 Software.ResultsThe blood inflammatory markers,including rheumatoid factor(RF),C reactive protein(CRP),erythrocyte sedimentation rate(ESR)in patients of active stage were increased significantly.The synovial hyperplasia,the miR-146a expression level in patients of active stage were significantly higher than those of inactive stage(P＜0.05).There was no significant difference between the two groups in anti-CCP antibody,synovial blood flow grading and synovial artery RI(P＞0.05).There was significantly positive correlation between miR-146a and synovial hyperplasia thickness,grade of blood flow,RF in active RA patients(P＜0.05), but there was no significant correlation between miR-146a and other inflammatory markers(ESR,CRP,anti CCP) in the blood(P＞0.05).In inactive patients,miR-146a showed no association with inflammatory indexes(P＞0.05).ConclusionmiR-146a shows high expression in active RA plasma,and is associated with specific indicators of disease activity degree,which can be used as a predictor of disease activity degree of RApatients.

Aheumatoid arthritis(RA);microRNA(miRNA);Disease activity degree

R593.22

A

1003—6350（2015）08—1167—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.08.0417

2014-09-22)

劉 磊。E-mail：kw.wang2008@gmail.com