N/P比對煙草黑脛病菌生長的影響研究

陳方旭　黃保宏　高正良等

摘 要：煙草黑脛病是煙草上的毀滅性病害，主要通過帶菌土壤和病殘體進行傳染。該文通過研究不同N/P比與煙草黑脛病菌生長的關系，找出病菌生長的最適氮磷比例。試驗以硝酸鈉為氮源，以磷酸二氫鉀為磷源，最終得出黑脛病病菌生長的最適氮磷比為3∶2，若氮肥量過多高出磷肥，病菌生長速率也很快，單施鉀肥使病菌生長速率減慢。因此，在實際生產中應避免加重病害發生的施肥比例，以控制病害的發生。

關鍵詞：煙草；黑脛病病菌；生長；氮磷比

中圖分類號 S43 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）06-79-04

煙草黑脛病（Phytophora nicotiana Breda deHaan）是煙草上主要的毀滅性病害之一，最早是1896年由van Breda de Haan發現于印度尼西亞的爪哇[1]，從苗期到成株期均可發病，發病率高，分布范圍廣，造成的經濟損失巨大。人們曾嘗試用農業防治、生物防治、化學防治等多種方法控制該病害的危害，但由于該病菌的游動孢子形成速度快且數量大，侵染煙株后潛育期短、發病快，在一個生長季節可以發生多次再侵染，有時還與其他病害混合發生，因而始終無法獲得理想的防治效果。煙草對于農藥殘留、病原菌耐藥性以及在質量有特殊的要求[2]，因此，在煙草及煙草制品逐漸向無公害方向發展的趨勢下，有必要從多角度探討控制煙草黑脛病的最佳途徑，以尋找新的防治方法。

N、P是微生物及煙草生長不可缺少的營養元素，只有確定合理的N、P施肥比例，才能產出優質煙草，同時又不人為地加重病害發生程度。為此，筆者以生態防治為指導思想，從施肥的角度，研究不同N/P比對煙草黑脛病菌生長速率、形態等方面的影響，找出最適于病菌生長的N/P比，從而指導實際生產中合理施肥，并以此來控制煙草黑脛病病害的發生，以減輕煙草種植過程中的損失，提高經濟價值。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 儀器 顯微鏡、全自動電熱壓力蒸汽滅菌箱（YXQ-LS-SⅡ）、立式循環通風干燥箱（101A-2C）、智能人工氣候箱（RXZ 106L-A光照度3000）、潔凈工作臺（SW-OJ-2F）、分析天平等。

1.1.2 器具 培養皿、1mL注射器、接種餅、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、棉花、紗布、棉線、酒精燈、接種環、接種針等。

1.1.3 藥品 硝酸鈉、磷酸二氫鉀、升汞溶液、酒精、蒸餾水、無菌水、葡萄糖、馬鈴薯、瓊脂等，試劑均為國產分析純試劑。

1.1.4 菌種 采集鳳陽煙草所煙田中典型煙草黑脛病株進行分離純化得到煙草黑脛病菌。

1.2 試驗設計

1.2.1 試驗方法 采用隨機區組設計二因素試驗統計方法[3]。

1.2.2 有效含量及各處理設計 根據大田實際情況施肥量5～20kg/667m2[4]以及培養皿面積為0.063 585m2（培養皿半徑為4.5cm），試驗設計以有效含量為0.15g/皿為標準。由于硝酸鈉有效含氮量為16.47%，磷酸二氫鉀有效含磷量為22.19%，因此有效氮0.910 7g（硝酸鈉）=有效磷0.658 7g（磷酸二氫鉀）。根據前期預備試驗，不斷細化配比，處理Ⅰ、Ⅱ加入單純氮源和單純磷源以探索單一施肥對病菌生長的影響，并與氮磷配合施肥作比較；中間（處理Ⅲ～Ⅶ）共5個處理按等比數列分別設置N/P比為6∶1、3∶1、3∶2、3∶4、3∶8，探索最適病菌生長比例，最后一個處理設為空白對照，共8個處理，每個處理重復3次。處理質量設計如下：（1）保證天平所造成的測量誤差≤±0.1%；（2）因PDA易凝固，所以將試劑制成試液，各組處理試劑均用10mL無菌水水稀釋，且均加入10mL培養基，使得實際配置藥液稀釋2倍；因此，試劑質量依有效含量質量的2倍（即0.30g/皿）來設計稱量質量。8個處理試劑質量如下：Ⅰ：1.821 4g硝酸鈉；Ⅱ∶1.3162g磷酸二氫鉀；Ⅲ∶硝酸鈉（1.561 2g）∶磷酸二氫鉀（0.188 0g）=6∶1；Ⅳ：硝酸鈉（1.366 0g）∶磷酸二氫鉀（0.329 0g）=3∶1；Ⅴ：硝酸鈉（1.092 8g）∶磷酸二氫鉀（0.536 4g）=3∶2；Ⅵ：硝酸鈉（1.040 8g）∶磷酸二氫鉀（0.752 0g）=3∶4；Ⅶ：硝酸鈉（0.496 8g）∶磷酸二氫鉀（0.957 2g）=3∶8；Ⅷ：空白對照（ck）。

1.2.3 菌種、接種方法及培養環境 （1）菌種：由大田采黑脛病植株，依據其病原形態[5]，分離出病菌，并連續培養，經顯微鏡觀察符合黑脛病病菌病原形態后，利用柯赫式法則檢驗，最后得純種。（2）采用直徑為0.5cm的接種餅接大小一致的菌餅置于培養基中央。（3）培養基：由于煙草黑脛病為真菌（疫霉屬）病害，因此采用PDA培養基。在將培養基倒入培養皿之前，每皿注入3mL試液，而后倒入培養基，及時混勻，即成為試驗所需培養基。（4）培養環境：由于煙草疫霉菌喜高溫、喜高濕，菌絲生長最適溫度為28～32℃，孢子囊產生最適溫度為24～28℃，游動孢子活動和發芽的最適溫度為20℃，孢子囊在空氣相對濕度97%～100%時生長最快，光有抑制孢子囊發芽的作用[6-8]。綜合以上所有因素，試驗設計培養條件為溫度：30℃；濕度：98%；光暗交替：每12h。

1.3 測定項目及分析方法

1.3.1 試驗測定項目及測定方法 （1）顯微鏡鑒定純菌種，并運用柯赫式法則鑒定；（2）十字交叉法測定每個處理的生長直徑，每24h測定一次；（3）目測菌絲生長形態：疏密程度，氣生菌絲生長情況，菌絲厚薄。

1.3.2 分析方法

1.3.2.1 黑脛病菌種鑒定 由于試驗病菌從黑脛病病株上分離純化而得，因此需鑒定病菌。首先依據煙草黑脛病的病原為卵菌門疫霉屬，氣生菌絲較細，無色透明，無隔膜，孢子囊頂生或側生，梨形或橢圓形，頂端有乳頭狀突起。適宜條件下，可產生3～30個游動孢子。游動孢子無色，側生兩根不等長鞭毛[3，9-10]。將所產生孢子挑出（少量），置于載玻片，于顯微鏡下觀察，找出符合病菌生理形態的菌種。然后將顯微鏡鑒定的菌種培養純種，種植健康煙草，運用柯赫式法則回接，依據其癥狀表現，即莖基部受害后出現黑斑，并環繞全莖向上部延伸，有時病斑可達病株高度的1/3～1/2，病株葉片自下向上依次變黃。由此癥狀證實試驗所用菌種為黑脛病病菌。

1.3.2.2 生長半徑 依據十字交叉法[11]測得直徑為d1、d2，則r=（d1+d2）/2，由于每一個處理有3組重復（r1、r2、r3），最后半徑取三者平均數，即r=（r1+r2+r3）/3即得試驗所需半徑。

1.3.2.3 生長速率 生長半徑每24h記錄一次，記錄時均減去菌餅直徑0.5cm，設第1天記錄的半徑為R1，第2天為R2，第3天為R3，因此第一個24h生長速率V1=（R2-R1）/24，第二個24h生長速率為V2=（R3-R2）/24。

1.3.2.4 數據分析 通過DPS數據處理系統、方差分析及多重比較法，并找出菌絲密集，且孢子較多等生理形態，找出最適病菌生長的N/P比。

2 結果與分析

2.1 病原及形態 黑脛病病菌氣生菌絲較細，無色透明，無隔膜，孢子囊頂生或側生，梨形或橢圓形，頂端有乳頭狀突起。適宜條件下，可產生3～30個游動孢子。游動孢子無色，側生兩根不等長鞭毛，在水中游動，遇寄主時失去鞭毛，產生牙狀管侵入植株，條件不適宜時，孢子囊也能直接萌發出芽管侵入。

2.2 不同N/P比對煙草黑脛病病菌生長速率的影響

2.2.1 不同處理的煙草黑脛病病菌生長情況 由表1可以看出，處理Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ菌絲生長較密，且菌絲生長長度較長，菌落形態較厚，處理Ⅱ、Ⅶ菌絲較疏松，菌落形態薄，菌絲長度較短，依據形態及生長所需時間，預估處理Ⅴ為候選最適煙草黑脛病病菌生長的氮磷比。

由圖1可以看出，8個處理中：（1）加單純P和N中，處理Ⅱ（1.316 2g磷酸二氫鉀）即加入單純的磷源，生長最慢，同時也比空白生長慢，長滿培養皿所需時間比空白及其他處理的時間長，由此可見單純施磷肥不會增加病害發生率；單純給予氮營養時，病菌生長僅比空白慢，較其他處理生長快，由此可見氮肥應與其他肥料配合施用，單獨施肥會增加病害發生幾率。（2）在N/P二者比例中，處理Ⅴ（N/P=1.5∶1）生長半徑以及生長形態較其他處理均為最快，且比空白生長快，初步估計若按此比例施肥會增加病害發生幾率；處理Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ生長情況相似，且均比較空白生長慢，預估生產中與這些處理類似的比例施肥會減少病害發生幾率。（3）各處理生長形態經比較，可知當N/P比例中，磷多得多時菌絲疏松且孢子很少甚至沒有，而氮多得多時，菌絲普遍比較密集，基本上均產孢。

2.2.2 不同處理的煙草黑脛病病菌平均生長速率 由圖2可知，各處理生長速率由慢至快為：Ⅱ<Ⅵ<Ⅳ<Ⅶ<Ⅷ<Ⅲ<Ⅰ<Ⅴ，即當氮磷肥配合施用時，處理Ⅵ（3∶4）生長速率較慢，處理Ⅴ生長速率最快；結合2.2.1分析，可知煙草黑脛病病菌在高氮低磷情況下生長速率相當快，且菌絲密集，產孢多且快，如處理Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ結合生長形態綜合判定使病菌生長最慢比例；當N/P比相差不大或者高磷低氮時，黑脛病病菌生長速率較慢，且菌絲均較短，疏松而產孢少。因此，施肥中氮肥的施肥量一定要把握準確，以免增加病害的發生幾率。

3 結論與討論

3.1 煙草黑脛病病菌最適氮磷比測定結果

3.1.1 單一施肥 煙草黑脛病病菌在單純以磷酸二氫鉀為磷源的的培養基上生長速率最慢，長滿培養皿所需時間最長，且當其他處理長滿時仍未產孢，與其他處理呈顯著性差異，但生產中往往不會單施鉀肥，若需要單施鉀肥，應按處理Ⅱ以計算每667m2施鉀肥量；而在以單純的硝酸鈉為氮源的培養基上生長速率僅次于空白和處理Ⅴ，因此在煙草種植過程中，單施硝酸鈉等氮肥時，病害發生可能性較大。

3.1.2 最適氮磷比得測定 由于實際施肥中是氮、磷肥配合施用，因此重點在于氮磷配比。綜合分析可知，處理Ⅴ，即N∶P=3∶2，為最適病原菌生長比例，若按此比例施肥，發生病害可能性較大，因此應避免此種施肥比例。

3.1.3 生產中適宜施肥配比 通過以上數據分析可知，處理Ⅳ（3∶1）、Ⅵ（3∶4）、Ⅶ（3∶8）是較單純施磷源生長較慢的幾個配比，結合圖1生長形態處理Ⅳ、Ⅵ菌絲生長較處理Ⅶ密集，處理Ⅵ較處理Ⅳ、Ⅶ菌絲長，處理Ⅳ、Ⅵ較處理Ⅶ孢子量多，因此，實際生產中氮磷配比按照與此3個處理接近比例，均可有效的通過合理施肥減小病害發生幾率。在實際施肥中，應遵循低氮的原則，少施氮肥，合理施肥，同時配合間作栽培模式，采取“預防為主，防治結合，綜合防治”的總體策略，通過加強栽培管理措施，以盡可能減輕煙草黑脛病病害的發生程度。

3.2 實驗測定的不足之處 試驗只選擇了硝酸鈉、磷酸二氫鉀2種藥物作為試驗營養肥來假設現實中的氮、磷肥，且選擇的施用量依南方地區施肥量而定，并不包含病菌生長所需的所有氮、磷源，由于目前較少有文獻通過研究N/P比對煙草黑脛病菌的生長狀況來指導施肥，控制病害發生，所以N/P比例設計不全面，因而結果有一定的局限性。

3.3 實驗的實際意義 研究表明，煙草黑脛病發生動態與連作狀況、寄主的抗感性及氣象因素呈一定的相關性。當前，較多文獻在栽培措施方面進行了大量的研究，對控制黑脛病的發生起到了很好的效果，但對施肥比例研究較少。由于目前仍然多采用藥劑防治，長期使用化學藥劑，不但會對環境造成嚴重的污染，而且會導致品種的抗病性逐年下降。因此，本試驗從栽培時施肥角度，研究不同N/P比與煙草黑脛病菌生長的關系，找出使病菌生長最快的N/P比以及使病菌發展較慢的N/P比，從而在實際生產中對合理施肥起到一定的指導作用，適當控制病害的發生。在今后的工作中，首先，應建立以烤煙為主的輪作制度，尤其是水旱輪作，以減少病原物和侵染源；其次，在栽培耕作時應按照適當比例施肥，將病害發生的可能性降至最低；第三，采用無公害的植物抗逆誘導劑來提高植物抗性，使易感病的優質品種轉變為抗病品種；最后，選用少量低毒高效、無殘留的農藥殺死和抑制病原菌。通過以上措施，可以減少煙葉的農藥殘留量，生產出無公害煙葉[12]。

參考文獻

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