不同灸溫的艾灸抗炎效應及TRPV1作用機制研究?

周 攀，張建斌，王玲玲，季 輝，謝 波

(南京中醫藥大學針藥結合實驗室，南京 210029)

不同灸溫的艾灸抗炎效應及TRPV1作用機制研究?

周 攀，張建斌，王玲玲△，季 輝，謝 波

(南京中醫藥大學針藥結合實驗室，南京 210029)

目的:探討不同灸溫對佐劑性關節炎大鼠血清炎癥因子的影響及瞬時受體電位香草酸亞型1(TRPV1)的作用機制。方法:將40只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、38℃艾灸組、45℃艾灸組、CPZ+45℃組，每組8只，以弗氏完全佐劑制備佐劑性關節炎模型。后3組于“腎俞”、“后三里”給予每天每穴10 min治療，控制穴區溫度為(38±1)℃或(45±1)℃。CPZ+45℃組先在穴區涂抹TRPV1阻斷劑辣椒平CPZ溶液，每10 min涂1次，30 min后再予45℃艾灸治療。治療5 d后測定腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β的濃度。結果:模型組TNF-α、IL-1β較空白組顯著升高。38℃組TNF-α較模組型降低，而IL-1β無統計學意義，45℃組TNF-α、IL-1β較模型組顯著降低。45℃組TNF-α、IL-1β較38℃組明顯降低。CPZ+45℃組TNF-α、IL-1β較45℃組明顯升高。結論:灸法具有良好的抗炎作用，灸溫的高低直接影響治療療效，TRPV1在感知灼痛溫度(＞43℃)后，參與了艾灸抗炎效應。

灸溫;炎癥因子;瞬時受體電位香草酸亞型1

近年來研究表明，灸法臨床優勢病種有34個［1］，與免疫有關的占94%，可見利用灸法進行多種病證的治療過程中，其抗炎免疫特性發揮著十分重要的作用。影響灸法抗炎免疫特性的因素有很多，灸溫是關鍵因素之一［2-4］，目前尚缺乏灸溫高低對灸法療效影響的量化實驗研究。

隨著現代分子生物學的發展，軀體及皮膚組織中許多能夠感受溫度變化的蛋白受體(瞬時受體電位通道，transient receptor Potential，TRP)相繼被發現。其中，瞬時受體電位香草酸亞型1(Transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)是目前研究最多的TRP家族成員，該通道亞型可被高于43℃熱刺激激活，引起細胞外的鈣離子內流，從而產生神經信息的傳導、肌肉收縮、神經遞質釋放、細胞分化增殖、基因轉錄和細胞凋亡等一系列復雜的生物活動。灸法產生的抗炎效應很可能與溫度激活TRPV1有關。

45℃是人們首先感受疼痛的平均臨界值，也是組織開始被熱損傷的溫度［5］。本研究將38℃和45℃作為恒溫控制條件，探討不同灸溫對佐劑性關節炎大鼠血清炎癥因子的影響，同時引入阻斷劑辣椒平來進行TRPV1被阻斷前后的對比性研究，以期進一步明確TRPV1與灸法抗炎效應的關系，為探討灸法抗炎療效的本質提供一些新思路。

1 實驗材料

1.1 動物及分組

選用清潔級健康成年雄性SD大鼠40只，體質量(200±20)g，購自南京醫科大學實驗動物中心(合格證號SCXK(蘇)2008-0004)。本實驗過程中對動物處理符合2006年科學技術部發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。適應性喂養1周，飼養環境為溫度20～28℃，相對濕度50% ～70%。將40只SD大鼠隨機分出8只作為空白組，其余32只均采用右后足趾皮墊注入弗氏完全佐劑(FCA)制備急性佐劑性關節炎模型，24 h造模成功后再隨機分成模型組、38℃艾灸組、45℃艾灸組、CPZ+45℃組，每組各8只。

1.2 藥品及儀器

弗式完全佐劑 FCA溶液(10 ml，068K876，Sigma)，特制清艾條(7 mm×200 mm南陽漢醫艾絨有限責任公司)，辣椒平Capsazepine(5 mg，C191，Sigma)，吐溫80(批號20120319，成都科龍化工試劑廠)，無水乙醇(南京寧試化學試劑有限公司)，生理鹽水(批號 e120411c，安徽環球藥業股份有限公司)，烏拉坦(上海青析化工科技有限公司)，IL-1β試劑盒(KGERC007，南京凱基生物科技發展有限公司)，TNF-α試劑盒(KGERC102a，南京凱基生物科技發展有限公司)，CT14D臺式高速離心機(上海天美生化儀器設備工程有限公司)，酶標儀(240351，美國BioTek公司)，測溫儀(TES1310TYPE-K測溫儀，南京中醫藥大學針藥結合實驗室提供)。

2 實驗方法

2.1 造模方法

采用弗式完全佐劑(FCA)造模法，大鼠右后足趾皮墊下注入0.15 mlFCA溶液。24 h后右后足踝關節明顯紅腫，提示急性造模成功。配制濃度為0.5%的辣椒平溶液，溶媒成分為吐溫80、無水乙醇、生理鹽水比例為1∶1∶8。

2.2 治療方法

選穴“腎俞穴”、“后三里穴”［6］。用自制黑布袋將大鼠俯臥位固定，備皮刀剔除穴位區1 cm2面積的鼠毛暴露出局部皮膚，用記號筆標記穴位定位?？瞻捉M注入0.15 ml的生理鹽水;模型組同實驗組抓取、剃毛，不給予艾灸及藥物干預刺激。38℃艾灸組采用雀啄灸(上下移動頻率120次/min，艾條距離穴位距離為(30±15)mm，每20 s彈灰1次)，使穴區皮膚溫度為(38±1)℃，測溫儀探頭置于施灸穴區皮膚表面以監測實時溫度;45℃艾灸組采用雀啄灸(頻率120次/min，艾條距離穴位的距離為10 mm±5 mm，每5 s彈灰1次)，使穴區皮膚溫度為(45±1)℃(測溫儀監控);辣椒平(CPZ)+45℃組施灸前在穴位局部涂抹0.5%辣椒平溶液，每10 min涂1次共涂3次，30 min后施艾條雀啄灸，灸溫控制在(45±1)℃。各治療組皆灸取雙側“腎俞、后三里”，每穴10 min，每日1次，連續治療5 d結束后麻醉摘眼球取血。

2.3 觀察指標及檢測方法

用20%烏拉坦腹腔注射1 g/kg，麻醉約5 min后摘眼球取血4～6 ml。將全血靜置2 h，4℃3000 rpm離心15 min，取上清液分裝于0.5 ml離心管，置-20℃保存。采用酶聯免疫吸附法(ELISA)法檢測血清中的腫瘤壞死因子TNF-α、白介素1β濃度。

2.4 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。數據以均數±標準差(±s)表示，采用完全隨機設計的單因素方差分析，組間比較選用LSD法，檢驗標準取α= 0.05。

3 結果

3.1 溫度刺激對大鼠血清TNF-α、IL-1β影響

表1顯示，與空白組比較，模型組TNF-α、IL-1β顯著升高，差異有統計學意義(P＜0.01)，說明弗氏完全佐劑導致大鼠血清呈高炎癥反應狀態。與模型組比較，45℃艾灸組TNF-α、IL-1β顯著降低，差異有統計學意義(P＜0.01)，表明45℃灸溫可以明顯降低炎癥因子水平，具有抗炎作用。與模型組比較，38℃艾灸組TNF-α降低，差異有統計學意義(P＜0.05)，IL-1β有所降低，但差異無統計學意義(P＞0.05)，表明38℃灸溫降低炎癥因子水平有限。

表1 溫度刺激對大鼠血清TNF-α、IL-1β的影響(±s)

注:與空白組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01

組別 鼠數 TNF-α(pg/ml) IL-1β(pg/ml)空 白 組8 12.95±1.22 4.06±0.84模 型 組 8 78.96±4.751) 45.37±3.431)3 8℃ 艾灸組 8 74.72±4.302) 43.55±2.85 4 5℃ 艾灸組 8 46.98±2.183) 32.98±3.813)

3.2 不同灸溫及藥物干預對大鼠血清TNF-α、IL-1β的影響

表2顯示，與38℃艾灸組比較，45℃艾灸組TNF-α、IL-1β明顯降低，差異有統計學意義(P＜0.01)，表明45℃灸溫抗炎作用優于38℃。與45℃艾灸組比較，CPZ+45℃組TNF-α、IL-1β明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.01)，表明辣椒平阻斷了45℃灸溫抑制炎癥因子的效應。

4 討論

本實驗結果表明，艾灸可降低佐劑性關節炎大鼠血清中的TNF-α、IL-1β水平，具有抗炎作用，較高的灼痛感45℃治療作用明顯優于較低的溫和感38℃，說明溫度的高低直接影響艾灸抗炎療效。在人體可接受的溫度范圍內，提高灸溫即可提高艾灸療效。

表2 不同灸溫及藥物干預對大鼠血清TNF-α、IL-1β的影響(±s)

表2 不同灸溫及藥物干預對大鼠血清TNF-α、IL-1β的影響(±s)

注:與38℃艾灸組比較:1)P＜0.01;與45℃艾灸組比較:2)P＜0.01

組別 鼠數 TNF-α(pg/ml) IL-1β(pg/ml) 3 8℃艾灸組8 74.72±4.30 43.55±2.85 4 5℃艾灸組 8 46.98±2.181) 32.98±3.811)CPZ+45℃組 8 75.28±4.192) 48.56±3.752)

TRPV1廣泛分布于感受傷害性信息的神經末梢及鼻黏膜、呼吸道、肺、胃黏膜、皮膚等非神經組織［7］。目前認為，TRPV1可引起細胞外的鈣離子內流，在炎性痛、內臟痛及痛覺敏化中均發揮著重要作用［8］。辣椒平是最早發現可以阻斷TRPV1的拮抗劑，其抑制鈣離子內流的IC50為0.65 mmol/L［9］。本實驗通過CPZ+45℃組與45℃艾灸組的抗炎效應比較，前者TNF-α、IL-1β水平皆高于后者，說明經辣椒平預處理后艾灸的抗炎療效減弱。據此可推測，在艾灸治療炎癥的過程中，TRPV1激活與否影響了治療療效，即TRPV1參與了45℃灸溫的抗炎效應。

TRPV1可被辣椒素、H+、熱和機械刺激等多種理化因素激活［10-11］，其中熱刺激溫度達到43℃方可被激活，這也是上述“較高的灼痛感45℃治療作用明顯優于較低的溫和感38℃”的原因。實驗結果指導臨床，人體可接受的灼痛感溫度為 40.9～46℃［12］。采用麥粒灸療法［13］，通過對艾粒大小、壯數多少、質地松緊及移走快慢等進行精細控制，即可獲得這種灼痛感的溫度。目前臨床廣為運用的是溫和灸，也可通過改變操作技巧達到如麥粒灸穿透樣的灼痛感溫度。臨床患有肝炎、中風、腫瘤、強直性脊柱炎等難治性疾病的患者，應權衡療效與灼痛的利弊，堅持數年灼痛感的灸療后，方可提高機體免疫力，改善免疫紊亂，緩解不適癥狀。因此，適度的灼痛感灸療值得在臨床推廣，以發揮艾灸這一古老療法的作用潛能。

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Research of Anti-inflammatory Effect About Different Moxibustion Temperatures and TRPV1 Functional Mechanism

ZHOU Pan，ZHANG Jian-bin，WANG Ling-ling△，JI Hui，XIE Bo
(Laboratory of Integrated Acupuncture and Medicine，Nanjing University of traditional Chinese Medicine，Nanjing 210029，China)

Objective:To explore the influence of different moxibustion temperatures on adjuvant arthritis rats serum inflammatory cytokines and transient receptor potential vanilloid 1 TRPV1 mechanism.Method:The 40 SD rats were randomly divided into a blank group，a model group，38℃ moxibustion group，45℃ moxibustion group and CPZ+45℃group.Using the freund′s complete adjuvant(FCA)established the model of adjuvant arthritis(AA)rats.Moxibustion was applied at the last three groups at“Shenshu”(BL23)and“Housanli”(ST36)for 10 min per acupoint per day，at the same time controlling the temperature at(38±1)℃ or(45±1)℃.CPZ+45℃ group daubed the TRPV1 blocker CPZ solution at acupoints，daubing once every 10 minutes，after thirty minutes moxibustion was applied controlling the temperature at (45±1)℃ simultaneously.After continuous five days treatment，serum was acquired.Enzyme-linked immune sorbent assay(ELISA)method was adapted to measure the concentration of tumor necrosis factor TNF-α and interleukin IL-1β. Results:The TNF-α and IL-1β in the model group were significantly higher than those in the blank group.The TNF-α of the 38℃ group was lower than model group，but the comparison of IL-1β without statistical significance，those of 45℃ group were lower than those of model group.The TNF-α and IL-1β of the 45℃ group were significantly lower than those of the 38℃ group.The TNF-α and IL-1β of the CPZ+45℃ group were significantly higher than those of the 45℃ group. Conclusion:Moxibustion has good anti-inflammatory effects，The temperature of high and low directly affects treatment efficacy，TRPV1 in perception of hot temperature above 43℃ participates in the anti-inflammatory effect of moxibustion.

Moxibustion temperature;Inflammatory cytokines;Transient receptor potential vanilloid 1

R245.81

:B

:1006-3250(2015)09-1143-03

2015-03-18

江蘇省普通高校研究生科研創新計劃項目(CXLX13_ 58);國家自然科學基金資助項目(81373750);國家重點基礎研究發展計劃(973)項目(2009CB522905)

周 攀(1987-)，女，醫學碩士，從事針灸的臨床與研究。

△通訊作者:王玲玲(1949-)，女，教授，博士研究生導師，從事針藥結合臨床與神經內分泌機制研究，E-mail:wanglingl@ gmail.com。