Nrf2在百草枯中毒致大鼠急性肺損傷中的表達和意義*

劉振寧，張順，高嵩嵐，郭峰，張紅雷，趙敏

（中國醫科大學附屬盛京醫院 急診科，遼寧 沈陽110004）

百草枯是一種速效高效觸殺型除草劑，其安全性高而且對環境無害，在全世界范圍內得到廣泛使用。我國作為農業大國，是目前世界生產和使用百草枯最多的國家之一。臨床上許多患者自殺性口服或者誤服百草枯成為百草枯中毒就診的主要原因。百草枯的中毒致死劑量較小，而且目前尚無特效解毒藥物，在臨床上病死率極高[1]。由于肺臟中存在著多胺攝取及其轉運系統[2]，百草枯結構與其相似，可競爭性抑制聚胺類物質的攝取及聚集，因此，百草枯中毒主要引起急性肺損傷（acute lung injury，ALI），最終導致呼吸衰竭[3]。

百草枯進入機體被肺泡上皮細胞攝取后，發生氧化還原反應，消耗了還原型輔酶Ⅱ（NADPH），并產生大量的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），損傷細胞結構并影響其生物學功能[4-5]。轉錄因子NF-E2相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）是機體內重要的抗氧化調節因子，與炎癥、衰老、腫瘤等很多疾病關系密切[6]。近年來，國內外學者發現Nrf2參與藥物對ALI的保護機制[7-9]，然而Nrf2在百草枯中毒致ALI的過程中所產生的作用，國內未見報道。本研究通過觀察和研究Nrf2在百草枯中毒致ALI中的表達，探索Nrf2在此過程中所產生的生物學作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百草枯（Sigma，美國），TNF-α 和IL-1β ELISA試劑盒（R&D，美國），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（南京建成生物有限公司，中國），Nrf2抗體（Santa，美國），TBP抗體（Abcam，美國），SABC免疫組織化學試劑盒和DAB顯色試劑（武漢博士德生物有限公司，中國），其余均為進口或者國產分析純化學試劑。

1.2 儀器與設備

顯微鏡（Olympus，日本），石蠟切片機和石蠟包埋機（Leitz，德國），電泳儀、半干轉印儀（BIO-RAD，美國），高速冷凍離心機（Sigma，美國），顯微攝像系統（Q cupture prol Evolution ncp 5.01 BX51，日本）。

1.3 實驗方法

48只雄性SpragueDawley大鼠，體重200～250g，由中國醫科大學實驗動物中心提供。將大鼠隨機平均分成兩組，百草枯中毒組按照20mg/kg劑量腹腔注射百草枯；對照組1ml生理鹽水腹腔注射。在相同條件下常規飼料飼養，自由取食和飲水，房間溫度（25±5）℃、濕度40%～60%，人工照明及黑暗各12h。在腹腔注射百草枯后4、8、24和72 h時，每個時間點各取出6只大鼠，使用10%水合氯醛300mg/kg腹腔麻醉。麻醉后將大鼠仰臥于鼠臺上固定，常規消毒后打開胸腔，使用5m l注射器刺入右心室，緩慢取血，避免溶血。將血放入10ml離心管中，4℃、3 000 r/min，離心10min，取上清分裝至1.5ml EP管中，每管放約0.5ml，置-80℃冰箱保存。心臟采血后，剪掉左心耳，使用生理鹽水沖洗肺組織，待清亮液體流出后，完整取出兩側肺組織，觀察肺組織顏色、質地、有無出血等病理變化。左肺使用4%多聚甲醛溶液固定，置4℃冰箱中保存；右肺液氮速凍后置于-80℃冰箱保存。

1.4 血清IL-1β、TNF-α、MDA含量和SOD活性測定

將收集的大鼠血清在4℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清，按照IL-1β、TNF-α、MDA和SOD試劑盒說明書檢測血清中IL-1β、TNF-α、MDA含量和SOD活性。

1.5 肺臟濕/干重比值測定

將右肺中葉用生理鹽水清洗后，濾紙吸干表面水分，稱量肺濕重。然后再把肺葉放入80℃烤箱中48 h后獲得肺組織干重，然后以公式計算肺濕/干重比值以評價肺組織水腫程度。計算方法：肺臟濕/干重（W/D）=肺濕重（mg）/肺干重（mg）。

1.6 肺組織損傷評分

取多聚甲醛固定好的大鼠肺組織，切割組織塊，至厚度約0.5 cm左右，常規組織梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋、連續切片，行HE染色。光鏡下觀察肺組織病理學變化，并按MIKAWA等[10]方法進行肺損傷評分。評分標準如下：①肺泡充血；②出血；③肺泡腔或血管壁中性粒細胞浸潤或聚集；④肺泡壁增厚和/或透明膜形成。分別依據病變輕重評0～4分（0：無病變或非常輕微；1：輕度病變；2：中度病變；3：重度病變；4：極重度病變）。各項評定分數相加為肺組織損傷總評分。

1.7 Western blot檢測肺組織核Nrf2的表達

按照細胞核蛋白提取試劑盒說明書，提取肺上皮細胞核蛋白，進行蛋白定量后，加樣品緩沖液煮沸5min，各取20μl加樣；使用10%聚丙烯酰胺凝膠在150 V、30 mA條件下電泳1.5 h；50 V條件下PVDF膜轉膜2 h；5%脫脂牛奶封閉，滴加Nrf2一抗（1︰50），4℃過夜；用含0.1% Tween 20的TBS沖洗5min×3次，再加入二抗（1︰500）室溫下孵育2 h，用0.1%TBST沖洗15min×3次，ECL發光檢測，X線顯影，掃描圖像，測得各條帶的灰度值，以TBP為內參對照標準后，比較其表達量的變化。

1.8 免疫組織化學染色

將肺組織切片用0.1mol/L PBS漂洗2次，3%H2O2孵育15min，PBS洗3次，3%Triton X-100孵育15 min。使用0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH 6.0）抗原修復15min，滴加10%正常山羊血清（PBS稀釋）封閉游離的結合位點，室溫20min，以減少非特異性染色，傾去切片上血清，滴加1︰500稀釋的兔抗鼠Nrf2抗體，4℃冰箱過夜。陰性對照以PBS代替一抗，4℃過夜。PBS洗3次，滴加生物素標記的山羊抗兔二抗工作液（1︰200），室溫孵育20min，PBS洗3次，滴加SABC，室溫20min。PBS沖洗5min×4次。DAB顯色劑顯色3min左右，自來水充分沖洗終止顯色。蘇木素復染30 s，分色，二甲苯透明，晾干。中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.9 統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析（one-way，ANOVA），P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清MDA、IL-1β、TNF-α 含量和SOD活性測定

百草枯中毒組大鼠血清中MDA、IL-1β 和TNFα 含量隨著中毒時間延長而明顯增加，血清中SOD活性則明顯下降，在中毒1 d時達到最低值（見圖1）。

2.2 肺濕/干重比值和肺組織損傷評分

圖1 百草枯中毒大鼠血清MDA、IL-1β、TNF-α 含量和SOD活性

百草枯中毒以后，大鼠肺組織逐漸出現水腫充血，肺濕/干重比值（W/D）隨著中毒時間延長而逐漸升高，在中毒1和3 d時比較明顯（見圖2A）。顯微鏡下所見肺泡結構破壞，肺間質水腫，大量炎癥細胞浸潤，肺損傷評分明顯增加（見圖2B）。

2.3 核Nrf2蛋白在肺組織中的表達及蛋白分析

圖2 百草枯中毒大鼠肺濕/干重比值和肺損傷評分

核Nrf2在正常肺組織上皮細胞、巨噬細胞和血管內皮細胞少量表達（見圖3A）。在百草枯中毒4和8 h時，核Nrf2在肺組織中表達變化不明顯，在中毒1和3 d時表達明顯增強（見圖3B、C）。Western blot結果表明，核Nrf2在1 d時達到高峰，與對照組比較差異有統計學意義（P<0.05）；3 d時與對照組比較，雖然有增加的趨勢，但是差異無統計學意義（P>0.05）（見圖3D）。

圖3 核Nrf2蛋白在百草枯中毒大鼠肺組織中的表達和蛋白分析

3 討論

肺臟作為百草枯作用的主要靶器官，ALI是臨床上急性百草枯中毒的主要并發癥，臨床上表現為進行性呼吸困難和嚴重低氧血癥。百草枯進入機體被肺泡上皮細胞攝取后，消耗大量NADPH，干擾正常呼吸鏈電子傳遞，影響生物氧化磷酸化，引起細胞功能衰竭[4]；此外，還原狀態的百草枯經微粒體NADPH、細胞色素C還原酶等催化，與分子氧作用形成大量氧自由基包括超氧陰離子O2-、過氧化氫H2O2、羥自由基OH-等，引起膜脂質過氧化反應，不飽和脂肪酸變為飽和脂肪酸，上皮細胞被氧化時生成MDA，使膜成分交聯和聚合，破壞膜磷脂結構和功能，最終導致肺泡結構的完整性和通透性發生障礙[5]。ROS的產生還可以激活中性粒細胞、單核巨噬細胞等炎癥細胞，釋放炎癥細胞因子包括腫瘤壞死因子（TNF-α 和TNF-β）、白細胞介素（IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10）等，進一步加重肺組織損傷。本研究結果顯示，在百草枯導致大鼠ALI模型中，肺組織W/D比值升高，肺組織病理顯示肺泡結構破壞、大量炎癥細胞浸潤、肺間質水腫，肺組織損傷評分明顯增加。同時也發現百草枯中毒后血清中MDA含量增加和抗氧化酶SOD活性降低，說明機體內氧化還原狀態失衡。

氧化應激反應是百草枯中毒肺損傷的關鍵始動環節，在整個過程中起到極其重要的作用。Nrf2是細胞防御氧化應激反應的中樞調節者[11]，在正常情況下，Nrf2通過與胞漿蛋白伴侶分子Keap1在胞漿中結合使其活性處于抑制狀態，限制Nrf2遷移至細胞核發揮功能；在氧化應激等條件刺激下，Nrf2與Keap1解偶聯，Nrf2產生激活并進入細胞核后與抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）結合[12]，即Nrf2/ARE通路，啟動下游編碼Ⅱ相解毒酶基因和抗氧化蛋白的轉錄[13]，如NAD（P）H醌氧化還原酶1（quinone oxidoreductase，NQO1）、谷胱甘肽-S-轉移酶（glutathione-S-transferase，GST）[14]、過氧化氫酶（catalase，CAT）、SOD[15]、血紅素氧合酶-1（heme oxygen synthase-1，HO-1）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等[16]，有助于維持機體內氧化還原平衡。

研究表明，目前很多呼吸系統疾病包括慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）、哮喘、急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）均與Nrf2有關。將Nrf2基因敲除的小鼠長期暴露于煙霧中，可以引起更嚴重的肺氣腫癥狀，體內抗氧化酶表達明顯減少，細胞凋亡數量明顯增加[17]。高氧狀態下，與野生型小鼠相比較，Nrf2-/-小鼠肺通透性增加，炎癥細胞浸潤，上皮細胞損傷嚴重，Nrf2下游的多種抗氧化酶（如GST、NQO1和HO-1）的表達明顯減少[18]。在高潮氣量機械通氣引起的呼吸機相關性肺損傷（ventilator induced lung injury，VILI）小鼠研究中，也有類似發現，Nrf2-/-小鼠肺泡、血管通透性和炎癥因子水平升高，ARE反應性谷胱甘肽合成酶水平減少，氧化還原平衡受到破壞[19]。Nrf2在顱腦損傷所致的ALI中同樣發揮著重要的調節作用，Nrf2-/-小鼠炎癥細胞因子（TNF-α、IL-1β 和IL-6）表達增多，抗氧化和解毒酶（NQO1、GST）明顯減少[20]。有學者研究[21]發現，多酚表兒茶素酸酯活化Nrf2/ARE通路反應可以減輕博來霉素誘導的大鼠肺損傷和纖維化，巨噬細胞和中性粒細胞產生的活性氧形成氧化性環境，導致Nrf2激活及其下游基因表達增加[22]。

本研究結果顯示，正常大鼠肺組織表達少量水平的Nrf2蛋白，免疫組織化學結果顯示正常大鼠肺組織Nrf2主要位于肺泡上皮細胞、巨噬細胞和血管內皮細胞。在百草枯導致肺組織損傷1 d時，Nrf2蛋白明顯增加，3 d時有所下降。Nrf2表達增加可能與百草枯激活體內氧化應激系統有關，使得Nrf2與Keap-1解離并進入細胞核內，激活下游的抗氧化酶，產生保護作用。有學者采用重組腺病毒載體Nrf2轉染百草枯作用下的A549肺上皮細胞，發現炎癥細胞因子、氧化應激因子以及凋亡相關因子均有不同程度的降低[23]。這與本研究結果相似，均提示Nrf2參與了百草枯導致ALI的過程，產生內在的保護作用。

總之，本研究結果表明，Nrf2參與了機體內在的保護作用，Nrf2有望成為治療百草枯中毒新的靶點。如果能使Nrf2表達增強則可以減輕百草枯的毒性反應，從而對百草枯所引起的ALI產生保護作用，具有良好的臨床應用前景。

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