三結構域包含蛋白29對鼻咽癌細胞生長和遷移的影響*

龍璐，王堃，陳貞，朱樂攀，易斌

（中南大學湘雅醫院 檢驗科，湖南 長沙410008）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我國南部最常見的惡性腫瘤之一，由于其早期病灶小，癥狀不典型，易忽略及誤診[1]，具有惡性程度高及易發生浸潤轉移的特點，病死率很高，嚴重威脅人們的身體健康和生命安全。侵襲和轉移是惡性腫瘤致死的根本原因。因此，篩選NPC轉移相關蛋白（基因），早期判斷NPC的轉移是降低死亡率的關鍵所在。

本課題組前期采用定量蛋白質組學技術研究發現，三結構域包含蛋白29（tripartite motif-containing protein 29，TRIM 29）、死骨片蛋白-1（sequestosome-1，SQSTM 1）、根蛋白（radixin，RDX）在高轉移潛能鼻咽癌細胞5-8F中和低轉移潛能鼻咽癌細胞6-10B中均表達上調。大量研究證實[2-5]，這3個基因與腫瘤的發生和轉移密切相關，但其在鼻咽癌研究中尚未見報道。因此，本文采用5-8F和6-10B兩株不同轉移潛能的鼻咽癌細胞系，檢測其TRIM 29、SQSTM 1、RDX基因的mRNA和蛋白表達水平，并在該基礎上進一步研究TRIM 29對5-8F細胞增殖及遷移能力的影響，為以后深入研究其與NPC轉移的關系提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 高轉移潛能鼻咽癌細胞系5-8F和低轉移潛能鼻咽癌細胞系6-10B，由衛生部腫瘤蛋白質組學重點實驗室提供。

1.1.2 主要試劑 小牛血清和流式單染試劑碘化丙錠（PI）購自Gibco公司，RPMI 1640購自Hyclone公司，脂質體2000和G418購自Invitrogen公司，PVDF膜和Luminata Crescendo Western HRP Substrate發光液購自Millipore公司，四甲基噻唑藍（MTT）購自Sigma公司，鼠抗人SQSTM 1抗體和鼠抗人TRIM 29抗體購自Santa Cruz公司，兔抗人RDX抗體、HRP標記的羊抗鼠IgG抗體和HRP標記的羊抗兔IgG抗體購自Abcam公司，鼠抗人β-actin抗體購自Auragene公司，TRIM 29、SQSTM 1、RDX基因及內參GAPDH引物均由上海吉凱公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 5-8F細胞和6-10B細胞用含12%小牛血清的RPMI 1640培養基，于37℃、5%二氧化碳恒溫培養箱中培養。

1.2.2 qRT-PCR 檢測TRIM 29、SQSTM 1、RDX基因的mRNA 表達水平 TRIM 29上游引物5'-T GCGAGCTGCATCTCAAGC-3'，下游引物5'-GGTGC TATGATTCTTGTGCTCC-3'，擴增片段長度為189 bp；SQSTM 1上游引物5'-GACTACGACTTGTGTAGCGT C-3'，下游引物5'-AGTGTCCGTGTTTCACCTTCC-3'，擴增片段長度為139 bp；RDX上游引物5'-GAGATGAAACCAAGAAAACAC-3'，下游引物5'-CTCACAT TGCTTCAAACTCA-3'，擴增片段長度為138 bp；內參GAPDH上游引物5'-TGACTTCAACAGCGACACC CA-3'，下游引物5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'，擴增片段長度為121 bp。反應條件：95℃3min，95℃30 s，53℃20 s，72℃30 s，47個循環。

1.2.3 Western blot 檢 測TRIM 29、SQSTM 1、RDX 蛋白表達水平 上樣量30μg。10%SDS-PAGE電泳，60 V電泳40min，待樣品進入分離膠后電壓調至120 V繼續電泳約90min，100 V轉膜60min，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗（TRIM 29 1︰200、SQSTM1 1︰100、RDX1︰2 500、β-actin 1︰2 500）4℃孵育過夜，二抗1︰12 000孵育90min，加適量發光液，用Chem-iDocTMXRS+System with Image LabTMSoftware進行自動發光成像。

1.2.4 s iR NA 的設計與合成 根據NCBI GenBank中TRIM 29基因（NM_012101）信息，按照siRNA干擾片段設計原則設計siRNA序列，由上海吉凱公司合成。上游引物：5'-GATCCCCCATCGCTATGTGAAC AACTACTCGAGTAGTTGTTCACATAGCGATGGTTT TTGGAT-3'，下游引物：5'-AGCTATCCAAAAACCAT CGCTATGTGAACAACTACTCGAGTAGTTGTTCACA TAGCGATGGGG-3'；空白質粒表達載體序列：TTCT CCGAACGTGTCACGT。BLAST序列分析證明所設計的序列與人其他編碼序列無同源性。

1.2.5 細胞轉染、分組及篩選陽性細胞 設對照組（只加脂質體）、空白質粒對照組及TRIM 29特異性siRNA組。轉染步驟按脂質體2000轉染試劑盒說明書進行。轉染結束后挑取克隆，Western blot驗證是否為陽性細胞。

1.2.6 MTT 檢測細胞增殖能力 將各組細胞以2 000個/孔的濃度接種于96孔板，MTT檢測7 d。490 nm處測定各孔吸光度值，繪制細胞生長曲線。實驗重復3次。

1.2.7 流式細胞儀檢測細胞周期 收集各組細胞1瓶，PBS洗滌3次，用預冷的70%乙醇充分混勻細胞，4℃固定24 h，制成細胞懸液，與Tris-HCl緩沖液（含20μg/ml RNA酶）混勻，37℃孵育30min，加50μg/m l碘化丙錠（PI）染液染色細胞DNA。實驗重復3次。

1.2.8 細胞劃痕實驗檢測細胞體外遷移能力 5×105個細胞接種于6孔板，常規培養，待細胞生長至90%左右匯合時，吸棄培養基，用200μl的Tip頭在皿底畫4條平行線，PBS清洗3遍，加入無血清培養基培養，于0、24和48 h倒置顯微鏡觀察拍照。利用Image J 1.46軟件對縮窄距離進行分析，按照以下公式計算細胞的遷移率。遷移率=（初始劃痕寬度值-相應點劃痕寬度值）/初始劃痕寬度值×100%。實驗重復3次。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，兩樣本比較用兩獨立樣本t檢驗，多組樣本比較用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 qRT-PCR檢測5-8F和6-10B中TRIM 29、SQSTM 1、RDX基因的m RNA表達水平

以5-8F細胞為參照，根據PCR各樣本的Ct值，運用2-ΔΔCt法，相對于參照基因表達倍數為2-ΔΔCt，根據2-ΔΔCt做兩組細胞的基因相對折合表達量分析（見圖1）。結果顯示，TRIM 29、SQSTM 1 mRNA表達水平在5-8F細胞中顯著高于6-10B細胞，RDX mRNA表達水平在5-8F細胞中顯著低于6-10B細胞，差異均有統計學意義（P<0.05）。

2.2 Western blot檢測5-8F和6-10B中TRIM 29、SQSTM 1、RDX基因的蛋白表達水平

5-8F細胞中TRIM 29、SQSTM 1的蛋白表達水平明顯高于6-10B細胞，差異有統計學意義（P<0.05），結果不僅證實了課題組前期的定量蛋白質組學研究結果，也提示TRIM 29、SQSTM 1與NPC細胞的侵襲轉移相關；但兩種細胞中RDX的蛋白表達水平差異無統計學意義（P>0.05），與本研究前期的定量蛋白質組學結果不一致，見圖2。

2.3 TRIM 29特異性siRNA質粒表達載體抑制TRIM 29蛋白表達

圖1 TRIM 29、SQSTM 1、RDX在5-8F和6-10B細胞中的mRNA表達水平

圖2 TRIM 29、SQSTM 1和RDX在5-8F和6-10B細胞中的蛋白表達水平

根據3種基因在不同轉移潛能鼻咽癌細胞系中的表達水平檢測結果，課題組對TRIM 29做進一步研究。構建TRIM 29特異性siRNA質粒表達載體并將其轉染5-8F，使TRIM 29表達沉默，Western blot驗證轉染效果。與未轉染的5-8F及轉染空白載體的5-8F細胞比較，轉染了干擾質粒的5-8F細胞TRIM 29表達水平明顯降低；未轉染的5-8F和轉染空白載體的5-8F細胞比較，TRIM 29表達水平差異無統計學意義，證明轉染成功。見圖3。細胞增殖能力結果見表1及圖4。由結果可見，各組細胞第0天的吸光度值基本一致（P>0.05），從第1天開始，5-8F/Si-TRIM 29細胞的吸光度值與5-8F細胞、5-8F/NC細胞比較，差異均有統計學意義（P<0.05），提示從第1天起5-8F/Si-TRIM 29細胞增殖速度明顯減慢；5-8F細胞與5-8F/NC細胞的MTT吸光度值比較差異均無統計學意義（P>0.05）。

圖3 Western blot檢測TRIM 29蛋白表達水平

圖4 MTT檢測3種細胞增殖

2.4 MTT檢測細胞增殖能力

MTT檢測5-8F、5-8F/NC和5-8F/Si-TRIM 29

表1 MTT檢測3種細胞增殖的吸光度值（A490 nm） （±s）

表1 MTT檢測3種細胞增殖的吸光度值（A490 nm） （±s）

注：?與5-8F和5-8F/NC比較，P<0.05

細胞株 第0天 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天5-8F 0.145±0.011 0.190±0.028 0.337±0.014 0.772±0.049 1.277±0.093 1.842±0.119 1.876±0.065 5-8F/NC 0.150±0.009 0.206±0.028 0.340±0.035 0.790±0.054 1.287±0.080 1.749±0.129 1.863±0.121 5-8F/Si-TRIM 29 0.155±0.014 0.148±0.004?0.287±0.037?0.407±0.046?0.777±0.076?1.220±0.074?1.380±0.062?

2.5 流式細胞儀檢測細胞周期

流式細胞儀檢測3種細胞周期結果見圖5及表2。結果顯示，與5-8F細胞、5-8F/NC細胞相比，5-8F/Si-TRIM 29細胞表現為明顯的G0/G1期細胞增加，而S期細胞減少，差異有統計學意義（P<0.05）；5-8F細胞與5-8F/NC細胞相比，各周期細胞數差異無統計學意義（P>0.05）。結果提示TRIM 29低表達有抑制鼻咽癌細胞增殖的作用。見圖5。

2.6 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

3種細胞0和48 h遷移情況見圖6。培養48 h后，與5-8F細胞、5-8F/NC細胞相比，5-8F/Si-TRIM 29細胞遷移能力明顯降低（P<0.05）；5-8F細胞和5-8F/NC細胞相比，遷移率差異無統計學意義（P>0.05）。5-8F細胞的遷移率為（0.733±0.012），5-8F/NC細胞的遷移率為（0.700±0.017），5-8F/Si-TRIM 29細胞的遷移率為（0.325±0.039），各組細胞遷移率比較見圖7。

圖5 5-8F、5-8F/NC和5-8F/si-TRIM 29細胞周期的分布

表2 5-8F、5-8F/NC和5-8F/Si-TRIM 29細胞周期的分布 （%，±s）

表2 5-8F、5-8F/NC和5-8F/Si-TRIM 29細胞周期的分布 （%，±s）

注：1）與5-8F比較，P<0.05；2）與5-8F/NC比較，P<0.05

細胞株 G0/G1期 S期 G2/M期5-8F 50.723±6.630 39.753±4.660 9.527±2.175 5-8F/NC 50.983±5.275 36.700±4.192 12.317±1.703 5-8F/Si-TRIM 29 69.530±5.1251）2） 23.313±4.9211）2） 7.157±1.3162）

圖6 劃痕實驗檢測5-8F、5-8F/NC和5-8F/Si-TRIM 29細胞的遷移能力

圖7 5-8F、5-8F/NC和5-8F/Si-TRIM 29細胞的遷移率比較

3 討論

同位素標記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術是一種新的、功能強大的可同時對4種或8種樣品進行絕對和相對定量研究的蛋白質組學技術，它具有高通量、高重復性、高敏感性和高精確性等特點。本課題組前期以5-8F和6-10B為模型，應用iTRAQ標記結合二維液相色譜質譜聯用技術（multi-dimensional liquid chromarography-mass spectrometry/mass spectrometry，2DLC-MS/MS）篩選出鼻咽癌轉移相關的差異蛋白190個，TRIM 29、SQSTM 1、RDX是其中3個在5-8F中較6-10B中表達上調的差異蛋白。

RDX是ERM（ezrin/radixin/moesin/merlin）家族成員，ERM家族為細胞骨架連接蛋白，ERM家族參與細胞生理狀態下的許多基本生命活動如細胞表面結構偽足及微絨毛等的形成、細胞間及細胞與基質間的黏附、信號傳導和細胞運動等[6]。本課題組前期研究結果發現RDX在5-8F中較6-10B中表達上調，提示RDX可能與腫瘤的轉移相關。但本研究中qRT-PCR結果顯示RDX在6-10B中表達較5-8F中高，差異有統計學意義，Western blot結果也顯示6-10B表達較5-8F中高，但差異無統計學意義。這種結果前后矛盾，因此課題組未對其與鼻咽癌轉移的關系進行下一步研究。出現這種情況的原因可能是iTRAQ為高通量地篩選細胞間差異表達蛋白的技術，影響因素很多，存在一定誤差。

SQSTM 1，也稱p62，是一種含有多種結構域的蛋白，有一些相互作用的結構域，包括PB1二聚化結構域、TRAF6結合位點和泛素相關結構域等，因此是一種多功能的泛素化結合的折疊蛋白，其在自噬調控[7]、凋亡[8]、蛋白酶體通路[9]、NF-κB[10]、Wnt等[11]信號通路中起重要的作用，從而與多種腫瘤密切相關。研究報道[13]，其高表達促進乳腺癌細胞的侵襲轉移[12]，低表達降低惡性膠質瘤細胞的侵襲性。本研究發現，SQSTM 1的表達水平在5-8F中較6-10B中明顯上調，這與前期定量蛋白質組學結果一致，再次證明SQSTM 1與鼻咽癌轉移有關，可能是預測鼻咽癌轉移和預后的一個重要的分子標志物，關于它的促轉移作用及其具體機制將另文報告。

TRIM 29基因，又稱為共濟失調性毛細血管擴張D組相關基因（ataxia telang-iectasia group D-associated protein，ATDC），位于11q23，屬于TRIM蛋白家族，由588個氨基酸組成，其蛋白結構含有多個鋅指結構基序和1個亮氨酸拉鏈基序，可能是一種轉錄調控因子[14]。文獻報道TRIM29在許多腫瘤中過表達，如肺癌[15]、胃癌[16]、膀胱癌等[17]。RU等[18]研究發現TRIM 29不僅促進癌細胞體外增殖，而且加快胰腺腫瘤的生長及體內擴散轉移。本研究發現，高轉移潛能的鼻咽癌細胞系5-8F中TRIM 29的表達水平明顯上調，與低轉移潛能鼻咽癌細胞系6-10B相比，差異有統計學意義，這與課題組前期定量蛋白質組學結果一致，說明TRIM29與鼻咽癌轉移有關。通過進一步利用siRNA干擾技術下調5-8F細胞中TRIM 29的表達水平，發現TRIM 29低表達后5-8F細胞的增殖能力降低，G0/G1期細胞增加，而S期細胞減少，說明TRIM 29可能是通過調節G0/G1期到S期細胞的變化來影響細胞周期的變化，從而影響細胞增殖。劃痕實驗顯示TRIM 29低表達后5-8F細胞的遷移能力下降，再次證明TRIM 29在鼻咽癌細胞中的促轉移作用。有研究報道[19]，TRIM 29促進非小細胞肺癌、結腸癌、宮頸鱗癌等腫瘤細胞的增殖與P53相關，其與P53相互作用，使P53駐留在細胞核外，并且抑制P53調節基因（P21和NOXA）的表達，從而促進腫瘤細胞的增殖和遷移。WANG等[20]發現TRIM29促進腫瘤細胞的增長和轉移是通過Wnt/β-catenin信號通路中的一個糖原合成酶激酶3β 抑制劑穩定β-catenin而實現的。而TRIM 29促進鼻咽癌轉移的機制目前尚未見報道，本課題組將進行后續研究。

綜上所述，siRNA干擾TRIM 29表達能明顯抑制鼻咽癌5-8F細胞的生長和遷移，說明TRIM 29在鼻咽癌細胞的生長和遷移中起重要作用。SQSTM 1也已證實與鼻咽癌轉移有關，因此TRIM 29、SQSTM 1有望成為鼻咽癌轉移的分子標志物，但其分子機制及臨床應用價值有待課題組進一步深入研究。

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