利用正交試驗篩選阿魏酸等四種藥物干預在體大鼠MIRI凋亡最佳組合

高宇勤，郝霽萍，賀少輝，趙國平

（1.西安市第九醫院心血管內科，陜西 西安710054；（2.暨南大學醫學院中西醫結合科，廣東 廣州510632）

·論 著·

利用正交試驗篩選阿魏酸等四種藥物干預在體大鼠MIRI凋亡最佳組合

高宇勤1，郝霽萍1，賀少輝1，趙國平2

（1.西安市第九醫院心血管內科，陜西 西安710054；（2.暨南大學醫學院中西醫結合科，廣東 廣州510632）

目的利用正交實驗方法探究阿魏酸、芍藥苷、甘草酸及肉桂酸四種藥物組合預處理對大鼠在體心肌缺血再灌注損傷(MIRI)的心肌細胞凋亡的干預作用，并尋找最佳藥物組合。方法本實驗采用了結扎SD大鼠心臟冠狀動脈前降支(LA)的方法建立在體大鼠心肌缺血再灌注損傷模型；采用L16(44)正交實驗設計和0.5%Evan's藍灌注心肌及1%TTC磷酸緩沖液孵育心肌觀察心肌壞死；利用TUNEL法檢測心肌細胞凋亡。結果比較各因素的極差發現阿魏酸、甘草酸、芍藥苷、肉桂酸對大鼠MIRI模型心肌梗死面積影響的順序是：芍藥苷＞甘草酸＞阿魏酸＞肉桂酸；阿魏酸、甘草酸、芍藥苷、肉桂酸對大鼠MIRI模型的心肌細胞凋亡指數影響的順序是：芍藥苷＞甘草酸＞肉桂酸＞阿魏酸；阿魏酸、甘草酸、芍藥苷、肉桂酸四藥混合干預大鼠MIRI心肌細胞凋亡指數最佳選擇方案是：芍藥苷(高劑量，100mg/kg)、甘草酸(高劑量，100mg/kg)、阿魏酸(中劑量，300mg/kg)、肉桂酸(中劑量，200mg/kg)。結論芍藥苷(高劑量，100mg/kg)、甘草酸(高劑量，100mg/kg)、阿魏酸(中劑量，300mg/kg)、肉桂酸（中劑量，200mg/kg)組合是降低心肌細胞凋亡、減少心肌梗死面積的最佳組合。

正交試驗；心肌缺血再灌注損傷；芍藥苷；甘草酸；阿魏酸；肉桂酸

缺血再灌注損傷(MIRI)是心肌缺血再灌注后出現的一種病理生理過程，通過預防缺血再灌注損傷可以顯著減少缺血心肌恢復血運后損傷，有利于改善預后。目前發現模擬性藥物預處理及后處理確實具有保護組織缺血再灌注損傷的作用[1]。芍藥苷、阿魏酸、肉桂酸、甘草酸等四種藥物是天然藥物中提取的成分，有研究提示上述四種藥物具有減輕心肌缺血再灌注損傷的作用[2-3]，但是這四種藥物對缺血再灌注損傷心肌細胞凋亡的干預是否具有優劣性差別，以及四種藥物如何組合才能發揮最大效果，目前尚無相關研究。正交實驗是一種篩選最佳藥物組合的重要研究方法，其根據正交性從全面試驗中挑選出部分有代表性的點進行試驗，這些有代表性的點具備了“均勻分散，齊整可比”的特點。正交試驗設計是分析因式設計的主要方法，通過此種實驗設計可以找出多因素中的最佳組合。本實驗利用在體大鼠冠狀動脈前降支(LAD)結扎術模型，采用正交實驗設計方法，探討芍藥苷、阿魏酸、肉桂酸、甘草酸四種活性成分預處理對心肌保護作用的優劣性及最佳組合，為尋找治療MIRI最佳的雞尾酒療法提供初步的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 芍藥苷、阿魏酸、甘草酸及肉桂酸購于南京澤朗醫藥科技有限公司(批號分別為ZL20090409SYG、ZL20090425AWS、ZL20090301GCS、ZL2008009RGS)，TNUEL試劑盒(KGA7032)購于凱基生物有限公司。

1.2 動物模型的建立 SPF級雄性SD(128只)大鼠，體重280～400 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供。許可證號：SCXK(粵)2008-0002，將大鼠稱重，注射2%戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉，固定大鼠仰臥于手術臺，頸部及胸部備皮消毒，頸部皮膚被縱形剪開1.5～2cm，分離皮下組織及肌肉，顯露氣管，行氣管插管，接呼吸機，調整呼吸頻率60次/min、通氣量20ml/kg?？v形剪開第三胸骨左緣胸部皮膚約4cm，鈍性分離，顯露胸膜，撐開肋骨，撕破心包，顯露心臟，確定縫扎位置(肺動脈圓錐與左心耳交界處下方2mm，前降支LAD近端位置)。用0號線，疊一個0.8～1mm的凹槽硅膠管，出針打結結扎LAD，缺血30min，松開結扎，復灌2 h。模型復制的可靠性ECGⅡ導聯ST段抬高為心肌缺血存在，以ST段回落1/2為再灌注成功。本實驗建模總共有12只SD大鼠因為麻醉和手術原因死亡，死亡率為9.3%。

1.3 分組及給藥方案 實驗選用L16(44)正交實驗表，每味藥為一種因子，其代號隨機選定，分別編為A甘草酸、B阿魏酸、C芍藥苷、D肉桂酸四種因子，取“不用藥”、“低劑量”、“中劑量”、“高劑量”四水平，分別設為1為不用藥，2為低劑量組，3為中劑量組，4為高劑量組四種水平。甘草酸：灌胃劑量分別為25mg/kg(低劑量)、50mg/kg(中劑量)、100mg/kg(高劑量)；芍藥苷：灌胃劑量劑量分別為25mg/kg(低劑量)、50mg/kg(中劑量)、100mg/kg(高劑量)；肉桂酸：灌胃劑量分別為100mg/kg(低劑量)、200mg/kg (中劑量)、400mg/kg(高劑量)；阿魏酸：灌胃劑量分別為200mg/kg(低劑量)、300mg/kg(中劑量)、400mg/kg (高劑量)；以上劑量都是全天劑量，灌胃1次/d，灌4 d，最后一次于手術前30min給予，見表1和表2。

表1 正交實驗設計因素及水平表(mg/kg)

表2 正交實驗L16(44)設計表

1.4 心肌梗死面積測定 實驗終點時暴露心臟，原位結扎左冠狀動脈主干，經主動脈逆行灌注(壓力為80mmHg，1mmHg=0.133 kPa)0.5%Evan's藍2～3ml，立即取心臟，以預冷生理鹽水沖洗殘余血液，將左室與其他心肌組織分離，快速置于液氮中，取出冷凍心臟，沿左室長軸方向連續環切，每片2～3mm，正常心肌組織為藍色，缺血區心肌組織為粉色，然后將無藍染缺血心肌置入1%TTC磷酸緩沖液(pH7.4)中37℃孵育20min，此時壞死區呈灰白色，非壞死區呈深紅色，其后將壞死區和非壞死區分離，濾紙吸干，置于電子天平上稱重。梗死面積以壞死心肌重量與缺血心肌重量(壞死區與非壞死區之和)之比表示。

1.5 心肌TUNEL凋亡原位檢測及步驟 再灌注結束迅速剪下心臟，置于冰磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗凈殘血，分離左心室前壁缺血邊緣區，于10%的中性甲醛固定12 h，經脫水、脫蠟、水合等過程制作成石蠟切片。按照TUNEL試劑盒方法操作(具體步驟略)。陽性細胞核呈棕黃色，陰性細胞核呈藍色。每張切片于缺血部位隨機選取8個高倍視野(×400倍)，分別記數凋亡心肌細胞數和心肌細胞總數并進行匯總，以凋亡心肌細胞數占心肌細胞總數的百分比作為凋亡指數=凋亡細胞數/心肌細胞總數。

1.6 統計學方法 應用SPSS13.0統計學軟件，計量資料數據以均數±標準差(±s)表示。16組之間進行正交設計的方差分析，同時應用正交實驗設計的直觀分析法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 心肌梗死面積測定結果 本實驗利用TTC磷酸緩沖液孵育(TTC為2，3，5氧化三苯基四氮唑，是脂溶性光敏感復合物，用來染色檢測哺乳動物組織的缺血梗死)無藍染的缺血心肌，壞死區呈灰白色，非壞死區呈深紅色。通過表3分析，比較各因素的極差發現阿魏酸、甘草酸、芍藥苷、肉桂酸對大鼠心肌缺血再灌注損傷模型心肌梗死面積影響的順序為芍藥苷＞甘草酸＞阿魏酸＞肉桂酸。

組別1234甘草酸(A)阿魏酸(B)芍藥苷(C） 肉桂酸(D)12345678910111213141516 K1 K2 K3 K4 Rj1342243141223341134243241331142211113244434232321342111322434234心肌梗死面積(%)0.30±0.070.13±0.030.13±0.100.27±0.030.17±0.160.07±0.040.10±0.060.11±0.090.07±0.030.10±0.030.10±0.010.12±0.020.13±0.070.11±0.040.14±0.050.13±0.040.160.160.120.100.060.150.160.100.130.060.210.110.130.090.120.160.140.120.120.04

2.2 心肌細胞凋亡指數測定結果 本實驗利用生物素(Biotin)標記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶的作用下可以連接到凋亡細胞中斷裂的DNA的3'-OH末端，并可與連接了辣根過氧化酶的鏈霉親和素特異結合，在辣根過氧化酶底物二氨基聯苯胺(DAB)的存在下產生很強的顏色反應(呈深棕色)，特異準確的定位凋亡細胞，該原理可檢測心肌細胞凋亡。通過表4分析，比較各因素的極差發現阿魏酸、甘草酸、芍藥苷、肉桂酸對大鼠MIRI模型心肌細胞凋亡指數影響的順序為芍藥苷＞甘草酸＞肉桂酸＞阿魏酸，通過方差分析(以α＜0.05為差異有統計學意義)發現芍藥苷、甘草酸、肉桂酸、阿魏酸差異均具有統計學意義(見表5)，其P值分別為0.000、0.000、0.000、0.041。根據心肌細胞凋亡指數實驗數據越小越有利，比較各因素不同水平的綜合平均值，再結合方差分析結果發現阿魏酸、甘草酸、芍藥苷、肉桂酸四藥混合干預大鼠心肌缺血再灌注損傷模型心肌細胞凋亡指數的最佳選擇方案為芍藥苷(高劑量，100mg/kg)、甘草酸(高劑量，100mg/kg)、阿魏酸(中劑量，300mg/ kg)、肉桂酸(中劑量，200mg/kg)。

表4 四種藥物干預大鼠MIRI心肌細胞凋亡指數正交實驗L16(44)直觀分析(±s)

表4 四種藥物干預大鼠MIRI心肌細胞凋亡指數正交實驗L16(44)直觀分析(±s)

組別1234甘草酸(A)阿魏酸(B)芍藥苷(C)肉桂酸(D)凋亡指數(%)12345678910111213141516 K1 K2 K3 K4 Rj13422431412233411342432413311422111132444342323213421113224342340.39±0.030.30±0.010.31±0.010.38±0.020.33±0.030.24±0.020.22±0.040.26±0.040.19±0.010.31±0.020.24±0.030.29±0.010.33±0.050.20±0.010.20±0.010.35±0.040.330.310.260.240.090.300.290.270.280.030.350.270.300.230.120.300.270.260.310.05

表5 正交實驗16組心肌細胞凋亡指數方差分析結果

3 討 論

有實驗研究發現，細胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷發病機制的重要環節之一，在人類心肌梗死尸檢中也發現，梗死灶收縮帶有明顯的細胞凋亡，和實驗室結果相符。因此細胞凋亡與心肌短暫缺血后再灌注損傷程度密切相關[4-5]，通過降低心肌細胞凋亡可以明顯減輕缺血再灌注損傷的程度。研究發現芍藥苷、甘草酸、肉桂酸、阿魏酸具有減輕心肌缺血再灌注損傷的作用[2-3]，但是上述四種藥物對心肌缺血再灌注損傷時出現的心肌細胞凋亡干預的優劣性以及它們是否可以協同增加抗凋亡作用和有無最佳雞尾酒組合，目前尚無研究，本實驗就是因此而設計。

正交實驗根據正交性從全面試驗中挑選出部分有代表性的點進行試驗，這些有代表性的點具備了“均勻分散，齊整可比”的特點，是分析因式設計的主要方法，通過此種實驗設計可以找出多因素中的最佳組合，特別適合多種因素交互作用的研究，本實驗就是利用此設計的優點來探討中藥多種成份的交互作用。

本實驗選用L16(44)正交實驗表分組，通過比較各因素的極差發現阿魏酸、甘草酸、芍藥苷、肉桂酸減少大鼠缺血再灌注損傷模型的心肌梗死面積作用強弱的順序為芍藥苷＞甘草酸＞阿魏酸＞肉桂酸。通過分析凋亡指數各因素的極差發現，上述四種藥物減輕心肌細胞凋亡的強弱順序也是芍藥苷＞甘草酸＞肉桂酸＞阿魏酸，說明上述四種藥物減少心肌梗死面積的效應與抗凋亡作用具有明顯相關性。根據心肌細胞凋亡指數實驗數據越小越有利，比較各因素不同水平的綜合平均值，再結合方差分析發現阿魏酸、甘草酸、芍藥苷、肉桂酸四藥混合干預大鼠心肌缺血再灌注損傷模型心肌細胞凋亡指數的最佳選擇方案是芍藥苷(高劑量，100mg/kg)甘草酸(高劑量，100mg/kg)阿魏酸(中劑量，300mg/kg)肉桂酸(中劑量，200mg/kg)。此最佳組合可能是一種有效的抗心肌細胞凋亡的雞尾酒組合。至于該組合機制的多靶點可能性，需要進一步研究明確。

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Screening of optimum drug combination of ferulic acid,paeoniflorin,glycyrrhizic acid and cinnamic acid for anti-cardiomyocyte apoptosis in the myocardial ischemia reperfusion injury of rats by orthogonal design in vivo.

GAO Yu-qin1,HAO Ji-ping1,HE Shao-hui1,ZHAO Guo-ping2.1.Department of Cardiovascular Medicine,Ninth Hospital of Xi'an,Xi'an710054,Shaanxi,CHINA;2.Department of Integrative Medicine,School of Medicine,Jinan University,Guangzhou510632,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo explore the effect of pretreatment with drug combinations of ferulic acid,and paeoniflorin,glycyrrhizic acid and cinnamic acid on cardiomyocyte apoptosis in myocardial ischemia reperfusion injury in rats,and to find the best drug combination.MethodsMyocardial ischemia reperfusion injury models were established by ligation of left descending coronary artery and reperfusion in SD rats.L16(44)orthogonal design,perfusion of0.5%Evan's blue and incubation of1%TTC were applied to observe myocardial infarction.Apoptotic index were detected by TUNEL.ResultsThe four drugs'effect on reducing infarct size of myocardium after ischemia/reperfusion from high to low was peoniflorin＞glycyrrhizic acid＞ferulic acid＞cinnamic acid,and the effect on reducing apoptotic index of myocardium after ischemia/reperfusion from high to low was peoniflorin＞glycyrrhizic acid＞cinnamic acid＞ferulic acid.The optimum drug combination was peoniflorin(100mg/kg),glycyrrhizic acid(100mg/kg),cinnamic acid(200mg/kg)and ferulic acid(300mg/kg).ConclusionThe drug combination of paeoniflorin(high dose,100mg/kg),glycyrrhizic acid(high dose,100mg/kg),ferulic acid(medium dose,300mg/kg)and cinnamic acid(medium dose,200mg/kg)is the optimum combination for lowering the myocardial apoptosis and reducing myocardial infarction area.

Orthogonal design;Myocardial ischemia reperfusion injury(MIRI);Paeoniflorin;Glycyrrhizic acid;Ferulic acid;Cinnamic acid

R-332

A

1003—6350（2015）22—3277—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.22.1191

2015-08-01)

國家自然科學基金(編號：81173189)；西安市衛生局科技項目及西安市科技項目(編號：SF1416)

郝霽萍。E-mail：470837625@qq.com