檢驗性失血對MODS大鼠血清促紅細胞生成素、血紅蛋白和器官功能的影響

周忠義，謝曉紅，田 佳，魏曉芬

(海南省人民醫院重癥醫學科，海南 海口 570311)

檢驗性失血對MODS大鼠血清促紅細胞生成素、血紅蛋白和器官功能的影響

周忠義，謝曉紅，田 佳，魏曉芬

(海南省人民醫院重癥醫學科，海南 海口 570311)

目的 探討不同檢驗性失血量對多器官功能障礙綜合征(MODS)大鼠血紅蛋白(Hb)、促紅細胞生成素(EPO)、器官功能及腎臟炎癥介質、氧化應激、細胞凋亡的影響。方法120只SD大鼠盲腸結扎穿孔(CLP)術后按照隨機數表法均分為四組：MODS組(M組)、MODS+檢驗性失血組1(ML1組)、MODS+檢驗性失血組2 (ML2組)、MODS+檢驗性失血組3(ML3組)，每組各30只。ML1組手術關腹后立即尾靜脈切開放血1 ml后壓迫止血，ML2組手術關腹后立即及術后24 h尾靜脈切開各放血1 ml后壓迫止血，ML3組手術關腹后立即、術后24 h及48 h尾靜脈切開各放血1 ml后壓迫止血。72 h統計各組病死率，每組取10只心臟取血2 ml，檢測Hb、肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)、谷丙轉氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、EPO、腫瘤壞死因子(TNF-α)，取腎臟組織檢測核轉錄因子(NF-κB)、丙二醛(MDA)和末端脫氧核苷酸轉移酶介導的脫氧尿苷三磷酸缺口標記(TUNEL)陽性細胞數。結果制模72 h，M組死亡10只，病死率為33.3%，ML1組死亡13只，病死率為40%，ML2組死亡15只，病死率為50%，ML3組死亡18只，病死率為60%，兩兩比較差異具有統計學意義(P＜0.05)。與M組比較，ML1、ML2、ML3組大鼠72 h Hb明顯下降，CK-MB、ALT、BUN、Cr、TNF-α、腎臟NF-κB、MDA和TUNEL陽性細胞數明顯增高，差異具有統計學意義(P＜0.05)。ML1組腎臟EPO濃度比M組略有升高，但差異無統計學意義(P> 0.05)，ML2、ML3組腎臟EPO濃度比M組明顯增高(P＜0.05)。結論檢驗性失血可能通過貧血、上調EP0水平、炎癥反應、氧化應激和促進細胞凋亡導致MODS大鼠器官功能障礙加重并影響預后。

盲腸結扎穿孔術；多器官功能障礙綜合征；檢驗性失血；促紅細胞生成素；細胞凋亡

盡管醫學不斷進步，但是膿毒癥(Sepsis)及其相關的多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)仍然是急危重癥患者的主要死亡原因。MODS患者因為內環境紊亂、病情復雜多變，需要頻繁抽血化驗，由此引起的檢驗性失血性貧血及其對病情的影響未引起臨床足夠的重視。姜東輝等[1]觀察到ICU患者抽血化驗用血量很大，每例患者總檢驗性失血量中位數為134.50 ml(32.5～751.5 ml)，患者的檢驗性失血與患者治療過程中器官功能障礙數目、Marshall評分、ICU住院日相關，我們認為檢驗性失血已成ICU中的一個潛在危機。本實驗模擬臨床檢驗失血觀察不同檢驗性失血量對盲腸結扎穿孔MODS大鼠血紅蛋白、促紅細胞生成素、器官功能、腎臟炎癥介質、氧化應激及細胞凋亡的影響，為臨床防治多器官功能障礙綜合征提供實驗和理論依據。

1 資料與方法

1.1 實驗動物分組 健康清潔級Sprague Dawley雄性大鼠120只、體重250～280 g，由海南醫學院動物實驗室提供。所有動物均自由覓食和覓水。按隨機數表法分為4組：MODS組(M組)、MODS+檢驗性失血組1(ML1組)、MODS+檢驗性失血組2(ML2組)、MODS+檢驗性失血組3(ML3組)，每組各30只。

1.2 實驗方法 所有動物實驗前夜禁食，自由飲水。10%水合氯醛(0.3 g/kg體重)腹腔注射麻醉，腹部正中線切開腹壁進入腹腔，行盲腸遠端起至回盲瓣50%處結扎，用9#針頭在盲腸結扎的中間位置全層穿透，并輕擠出少許糞便以保證穿孔處的開放性。盲腸放回腹腔，連續縫合關腹。各組均于術畢皮下注射生理鹽水30 ml/kg，以補充術中液體的丟失。所有動物手術在10 min之內完成，保持一致性，術后分籠飼養。ML1手術關腹后立即尾靜脈切開放血1 ml后壓迫止血；ML2手術關腹后立即及術后24 h尾靜脈切開各放血1 ml后壓迫止血；ML3手術關腹后立即、術后24 h及48 h尾靜脈切開各放血1 ml后壓迫止血。于72 h每組取10只經心臟取血2 ml并迅速放血處死，檢測大鼠血液中血紅蛋白(Hb)、肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)、谷丙轉氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、促紅細胞生成素(EPO)、腫瘤壞死因子(TNF-α)，取腎臟組織用10%甲醛固定，做組織病理切片，部分用于檢測核轉錄因子(NF-κB)、丙二醛(MDA)和末端脫氧核苷酸轉移酶介導的脫氧尿苷三磷酸缺口標記(TUNEL)陽性細胞數計數。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況及72 h病死率比較 四組大鼠12 h后出現病態，蜷縮，豎毛，呼吸急促，鼻腔溢出分泌物，眼角出現滲出物，活動、覓食、飲水減少，陸續有大鼠死亡。隨時間推移檢驗性失血組(ML1、ML2、ML3)大鼠精神萎靡，倦臥少動嗜睡，皮毛膨松枯槁，呈淺黃色，鼻唇淡白失澤，耳尾蒼白發涼，團縮拱背，病死數目增加，以ML3組最明顯，而M組大鼠48 h后一般情況有所好轉。制模72 h，M組死亡10只，病死率為33.3%；ML1組死亡13只，病死率為40%；ML2組死亡15只，病死率為50%；ML3組死亡18只，病死率為60%，兩兩比較差異均具有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 檢驗性失血72 h對MODS大鼠Hb、CK-M0B、ALT、BUN、Cr的影響 檢驗性失血組大鼠Hb明顯下降，CK-MB、ALT、BUN、Cr比M組明顯增高，兩兩比較差異均具有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

2.3 檢驗性失血72 h對MODS大鼠血清TNF-α、EPO、腎臟NF-κB、MDA、TUNEL細胞凋亡的影響 檢驗性失血組大鼠血清中TNF-α、EPO及腎臟NF-κB、MDA、TUNEL數目逐漸增高，兩兩比較除了ML1與M組血清EPO差異無統計學意義(P>0.05)外，余差異均具有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

表1 檢驗性失血72 h對MODS大鼠Hb、CK-MB、ALT、BUN、Cr的影響(±s)

表1 檢驗性失血72 h對MODS大鼠Hb、CK-MB、ALT、BUN、Cr的影響(±s)

注：與M組比較，aP＜0.05；與ML1組比較，bP＜0.05；與ML2組比較cP＜0.05。

組別Hb(g/L)CK-MB(pg/ml)ALT(U/L)BUN(mmol/L)Cr(μmol/L) M組(n=10) ML1組(n=10) ML2組(n=10) ML3組(n=10) 106.7±7.7 91.1±6.4a82.7±3.6ab70.9±1.9abc35.70±4.85 67.16±6.41a95.73±4.85ab108.17±5.37abc443.42±5.35 72.69±6.57a103.44±5.35ab143.29±6.98abc7.6±3.6 10.4±2.4a15.6±4.6ab25.5±6.2abc69.7±5.4 85.1±6.7a129.7±9.4ab188.2±11.8abc

表2 檢驗性失血72 h對MODS大鼠血清TNF-α、EPO、腎臟NF-κB、MDA、TUNEL細胞凋亡的影響(±s)

表2 檢驗性失血72 h對MODS大鼠血清TNF-α、EPO、腎臟NF-κB、MDA、TUNEL細胞凋亡的影響(±s)

注：與M組比較，aP＜0.05；與ML1組比較，bP＜0.05；與ML2組比較，cP＜0.05。

組別TNF-α(pg/ml)EPO(ng/ml)NF-κB(IOD)MDA(nmol/mg)TUNEL M組(n=10) ML1組(n=10) ML2組(n=10) ML3組(n=10) 56.503±4.30 67.141±6.52a86.503±4.38ab98.033±7.79abc1.86±0.49 1.91±0.51 2.34±0.62ab2.95±0.78abc8857.026±1217.827 9253.572±3114.180a11026.639±3256.705ab16256±5802.634abc8.56±0.46 9.82±0.82a11.79±1.05ab15.03±1.92abc4.67±2.03 9.46±1.52a14.37±2.68ab24.03±3.25abc

3 討 論

膿毒癥及其相關的多器官功能障礙綜合征(MODS)是ICU患者常見的合并癥，目前仍然缺乏有效的防治方法，是住院急危重癥患者的主要死亡原因，病死率高達50%～100%，嚴重威脅人類健康[2]。

MODS患者因為病情復雜多變、內環境紊亂，需要頻繁地抽血化驗以指導診斷和治療，由此導致的檢驗性貧血和器官功能損害卻未引起臨床醫師足夠的重視。Shaffer[3]觀察了43例機械通氣時間>24 h的ICU患者結果發現患者住院期間平均被采血(69±59)次，采血總量為(57±1120)ml，人均采血量為(245±213)ml，日均采血量為(16±7)ml，統計學分析得出患者檢驗性失血與病情嚴重程度、每天采血次數、采血量相關。進一步研究證明當人體每日失血量> 50 ml時就可能出現貧血，而且檢驗性失血不僅與貧血和輸血率的增加有關，還可能加重組織器官缺氧，使MODS患者雪上加霜，增加患者病死率和醫療費用[4]。本次動物試驗模擬臨床檢驗失血觀察從少到多檢驗性失血量對MODS大鼠72 h的影響發現Hb顯著下降，CK-MB、ALT、BUN、Cr顯著增高，病死率增加，證明檢驗性失血可導致貧血并加重多器官功能障礙和影響預后，失血量越大越明顯。

膿毒癥所致MODS是機體炎癥反應失控的結果，其核心是全身炎癥反應與代償性抗炎反應失衡[5]。TNF-α是細胞因子網絡相互調控的核心部分，可促進其他細胞因子和炎癥介質的釋放，產生炎癥的瀑布效應，啟動后續的一系列病理生理改變[6]。本研究結果發現，單純盲腸結扎穿孔術制模膿毒癥相關性MODS大鼠72 h血清TNF-α含量較低[(56.503±4.30)pg/ml]，從少到多檢驗性失血盲腸結扎穿孔術MODS大鼠血清中TNF-α顯著增高，表明MODS大鼠炎癥反應加重與檢驗性失血量相關，失血量越大炎癥反應越明顯。

臨床上膿毒癥相關性MODS合并腎臟損害常見，而且治療難度明顯增加。核轉錄因子(NF-κB)是細胞內重要的核轉錄因子，啟動和調控一系列炎性因子的基因表達，介導腎臟等臟器損傷[7]。采用免疫組化法檢測大鼠腎組織NF-κB表達，衡量大鼠腎臟炎癥反應水平；采用硫代巴比妥酸反應方法測定大鼠腎臟丙二醛(MDA)含量，評價脂質過氧化水平；采用TUNEL染色方法測定大鼠腎臟細胞凋亡數目。目前認為膿毒癥腎損傷發病機制與血流動力學的變化、內毒素與炎性介質、細胞凋亡等因素有關[8]。本研究發現膿毒癥相關性MODS大鼠檢驗性失血量從少到多72 h腎臟NF-κB、MDA、TUNEL陽性細胞數明顯增高，差異有統計學意義(P＜0.05)；提示檢驗性失血通過炎癥反應、氧化應激和促進細胞凋亡加重腎損傷。

EPO的作用是維持紅細胞造血前體細胞的存活并促進其分裂，誘導晚期紅系祖細胞生長成為成熟的紅細胞[9]。本次研究結果顯示，單次檢驗性失血MODS組大鼠72 h腎臟EPO濃度與對照組比較升高不明顯(P>0.05)，兩次以上檢驗性失血MODS組大鼠72 h腎臟EPO濃度明顯增高(P＜0.05)，表明檢驗性失血誘導MODS大鼠腎臟損傷時存在EPO高表達，提示多次檢驗性失血可能是EPO生成的主要刺激因素。

綜上所述，檢驗性失血可能通過貧血、上調EPO水平、炎癥反應、氧化應激和促進細胞凋亡導致膿毒癥相關性MODS大鼠器官功能障礙加重和影響預后。

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Impacts of different amounts of laboratory-testing blood loss on the hemoglobin,erythropoietin and organ function of rats with septic multiple organ dysfunction syndrome.

ZHOU Zhong-yi,XIE Xiao-hong,TIAN Jia, WEI Xiao-fen.Intensive Care Unit,People`s Hospital of Hainan Province,Haikou 570311,Hainan,CHINA

ObjectiveTo discuss the impacts of different amounts of laboratory-testing blood loss on the hemoglobin(Hb),erythropoietin(EPO),organ function,renal inflammatory medium,oxidative stress and cell apoptosis of the rats with septic multiple organ dysfunction syndrome(MODS).MethodsOne hundred and twenty SD rats were averaged into four groups through the random number table after CLP:MODS group(M),MODS+laboratory-testing blood loss group 1(ML1),MODS+laboratory-testing blood loss group 2(ML2),MODS+laboratory-testing blood loss group 3(ML3),with 30 rats in each group.When the surgery was finished and the abdomen was closed,1 ml of blood was drawn immediately after the tail vein phlebotomy in group ML1,then compression was performed to stop bleeding.In group ML2,1 ml of tail vein blood was taken respectively immediately after the surgery and 24 h after surgery,while in group ML3,blood samples was collected 24 h after surgery and 48 h after surgery.Fatality rate was calculated 72 h after the surgery.Ten rats in each group was selected and 2 ml of blood was taken from the heart for detecting Hb,creatine kinase MB(CK-MB),alanine aminotransferase(ALT),urea nitrogen(BUN),creatinine (Cr),EPO,tumor necrosis factorα(TNF-α).Malondialdehyde(MDA),nuclear factor-κB(NF-κB)in the kidney tissue,as well as the amount of TUNEL positive cells were also detected.ResultsAfter 72 h of moulding,10 rats died in the group M and the fatality rate was 33.3%,with 13(40%)died in group ML1,15(50%)died in group ML2 and 18 (60%)died in group ML3.The differences between each two groups were statistically significant(P＜0.05).Compared with group M,the Hb of group ML1,ML2 and ML3 all declined significantly,while the levels of CK-MB,ALT,BUN, Cr,TNF-α,MDA,NF-κB,and the amount of TUNEL positive cells all increased significantly(P＜0.05).EPO concentration in group ML1 was slightly higher than that in group M,but with no statistical difference(P>0.05).The EPO concentration in the group ML2 and ML3 was significantly higher than that in group M(P＜0.05).ConclusionLaborato-ry-testing blood loss could aggravate the organ function disorder and affect the prognosis of rats with septic MODS by anemia,EPO level up-regulation,inflammatory reaction,oxidative stress and cell apoptosis promotion.

Cecal ligation and puncture;Multiple organ dysfunction syndrome;Laboratory-testing blood loss;Erythropoietin(EPO);Apoptosis

R-332

A

1003—6350（2015）18—2665—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.18.0970

2015-04-14)

海南省衛生廳科研立項課題(編號：瓊衛2012PT-02)

周忠義。E-mail：adslzhouzy@sina.com