胎鼠肢芽軟骨染色技術的一點改進

夏卉芳

（1.貴州師范學院，貴州 貴陽 550018；2.貴州特色生物資源開發利用重點實驗室，貴州 貴陽 550018）

胎鼠肢芽軟骨染色技術的一點改進

夏卉芳1，2

（1.貴州師范學院，貴州 貴陽 550018；2.貴州特色生物資源開發利用重點實驗室，貴州 貴陽 550018）

目的 改進阿利新藍單染胎鼠肢芽軟骨技術，尤其是改進后的技術免用對人體有毒或致癌的試劑。方法將SPF級SD大鼠13～16 d齡的胚鼠前或后肢芽用阿利新藍染液染色、丙三醇透明，最后將透明好的肢芽標本用DPX樹脂鑲嵌在載玻片上待觀測。結果胎鼠前肢芽各部分發育分化的軟骨均被染成藍色，標本完全符合在體視顯微鏡下對肢芽軟骨是否畸形的觀測及前肢芽軟骨半定量Neubert 300分評價標準。結論阿利新藍單染胎鼠肢芽軟骨技術經改進后，肢芽軟骨染色好，實驗步驟簡化、時間縮短、節約成本、安全環保。

胚胎；肢芽；軟骨染色；阿利新藍

在致畸實驗中，胎鼠骨骼的畸形檢測是必須的，而對胎鼠骨骼進行染色評測是首選的檢測胎鼠骨骼畸形的方法[1-9]。目前國內、外常用的胎鼠骨骼染色方法有阿利新藍單染法或阿利新藍-茜素紅雙染法，其中阿利新藍單染法常用于染胎鼠的軟骨，雙染法用于染胎鼠的軟骨和骨。阿利新藍單染胎鼠軟骨技術應用于各種因素導致的胚胎骨骼畸形研究和胚胎骨骼形態發育的基礎研究領域[10-13]。

依據胎鼠肢芽軟骨染色技術相關文獻及多次試驗，現改進成一種專用于染鼠胚胎肢芽軟骨的簡易染色技術方法，此方法與原來的方法相比的優點在于：染好色的標本更加透明容易觀測，染色時間大大縮短至原來時間的1/4，經過簡化實驗程序使得幾種易爆有毒或致癌化學藥品去除，如二甲苯、Bouin's液(含福爾馬林、苦味酸)及含氨水的乙醇等[14-21]。現將胎鼠肢芽軟骨染色技術改進方法介紹如下：

1 材料與方法

1.1 染色液的配制 阿利新藍染液：先量取70%乙醇950 ml，再稱取阿利新藍干粉90 mg，最后用冰醋酸定容至1 000 ml。

1.2 方法

1.2.1 染色對象 SPF級SD大鼠14～16 d齡胚鼠的前或后肢芽(也可用SPF級昆明種小白鼠13～16 d齡的胚鼠前或后肢芽)。

1.2.2 染色步驟 (1)清洗肢芽：首先將上述肢芽放入培養皿中用pH6.8磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3遍，再用70%乙醇清洗肢芽三遍，6遍合計清洗1 h。(2)染色：將清洗好的肢芽轉入規格為50×30稱量瓶中用阿利新藍染液染色24 h。(3)脫水：將染好色的肢芽:分別用70%、80%、95%梯度乙醇各脫水10 min。(4)透明：將染好色的肢芽轉入純丙三醇中透明2 h[20]。(5)制片：最后將透明好的肢芽標本用DPX樹脂鑲嵌在載玻片上待測。

2 結果

使用改進染色方法染色的胎鼠前肢芽各部分發育分化的軟骨均被染成藍色，且各軟骨形態清晰可見且界限非常明確，皮膚及其他組織呈現透明無色。用改進胎鼠軟骨染色技術染色的標本完全符合體視顯微鏡下對肢芽軟骨是否畸形的觀測及前肢芽軟骨半定量Neubert 300分評價標準。結果見圖1和圖2。

圖1 E14前肢芽(阿利新藍染色，×10倍);圖2 E15前肢芽(阿利新藍染色且樹脂鑲嵌，×10倍)

3 討論

在致畸實驗中，胎鼠骨骼染色技術是直接關系到骨骼畸形的判斷，如果染色不夠清晰，常可被誤認為某個骨骼的缺失或骨發育延遲。尤其是對及其細小柔軟的鼠胚胎肢芽軟骨進行染色，一定要對標本的各個部位：肩胛骨、肱骨、尺骨、橈骨、腕骨和第1～5掌指骨都要染到位。

3.1 鼠肢芽軟骨染色改進前的缺點 既往對鼠肢芽軟骨染色經歷的程序：PBS沖洗、Bouin's液固定過夜、含0.05%氨水的70%乙醇脫色2 h以上(經常脫色不全，造成下一步的阿利新藍染液染色分界不清)、阿利新藍染液染色48 h、脫色液(無水乙醇:冰醋酸=3:1)脫色2 d、70%乙醇清洗1 h、95%乙醇脫水4 h、二甲苯透明2～6 h、70%乙醇清洗1 h、松木油保存。其程序繁瑣、染色時間長，尤其重要的是還要用到對人體有一定毒性或強烈致癌的化學藥Bouin's液(Bouin's液=苦味酸飽和液15份：福爾馬林5份：冰醋酸1份)固定、含0.05%氨水的70%乙醇脫色多次、二甲苯透明及其松木油保存。此法染色特點是時間所用時間長達109 h以上、要用到有害健康和環境及危險藥品。其中所用的試劑藥品福爾馬林具有強烈致癌作用；苦味酸屬于可產生紅血球損傷、腎炎、昏迷等人體危害易爆危險化學藥品；氨水是對呼吸道和皮膚有刺激作用并能損傷中樞神經系統形成對人身體健康危害的低毒類化學藥品；松木油的價格非常昂貴。

3.2 鼠肢芽軟骨染色改進后的優點 改進完善后的胎鼠肢芽軟骨染色技術方法不僅染色程序簡單、染色時間短、安全無毒，而且染色效果好。染色時間僅僅為27 h，大概為原來時間染色時間的1/4。由原來10個步驟109 h左右簡略到現在4個步驟27 h。安全無害：改進后的染色技術中減掉3種有害健康化學試劑：分別為、福爾馬林、苦味酸、氨水。染色中使用的材料非常簡單廉價：價格非常昂貴的松木油用低廉的丙三醇替代。從而大大節約了實驗成本及胎鼠肢芽軟骨的染色時間、更加重要的是整個染骨過程中無須用到有毒有害的化學藥品，保證了科研人員的身體健康安全。

綜上所述，改進后的肢芽染色技術不但有利于科研人員身體健康、生命安全，縮短實驗周期、改善環境，而且具有技術路線成熟可靠、染色效果清晰、染色與非染色區分界明顯、實驗結果明確等優點。改進后的肢芽染色技術同時兼有實驗效果好、省時、省錢、步驟簡單、生命安全性好等優點，是一種可靠并值得推廣的新技術方法。

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Some improvements to the staining of limb bud cartilage in fetal mouse.

XIA Hui-fang1,2.
1.Guizhou Normal College,Guiyang 550018,Guizhou,CHINA;2.Key Laboratory of Guizhou Characteristics Biological Resources Development and Utilization,Guiyang 550018,Guizhou,CHINA

Objective To improve the simple Alcian blue staining of limb bud cartilage in fetal mouse using no toxic or carcinogenic reagents.MethodsThe forelimb buds or hindlimb buds of SPF SD rats(13～16 days old)were stained by Alcian blueand then immersed in glycerol.The transparent specimens were placed onto the slide by DPX resin for observation.ResultsAll differential cartilage of forelimb buds were dyed blue.And all the specimens met the criteria of deformity observations under stereo microscope and the semi-quantitative Neubert 300 evaluation criteria of the forelimb buds cartilage.ConclusionThe improved Alcian blue simple staining technique could help enhance staining effect, simplify experimental procedure,shorten staining time and cut cost,and it was safe and environmental-friendly.

Embryo;Limb bud;Cartilage staining;Alcian blue

R-332

A

1003—6350（2015）06—0785—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.06.0282

2014-09-30)

教育部生物資源科學專業綜合改革試點項目(編號：2012287)；貴州省重點支持學科建設(編號：2011231)；貴州省應用化學特色重點學科[編號：黔教科研發(2012)442號]

夏卉芳。E-mail：xiahuifanggy@163.com