Ⅲ期NSCLC患者血漿中miR-21表達及其臨床意義

吳稚暉，李文燦，陳崇偉，李景和

(1.株洲市中心醫院胸外科，湖南 株洲 412000；2.中南大學湘雅醫院，湖南 長沙 410000)

Ⅲ期NSCLC患者血漿中miR-21表達及其臨床意義

吳稚暉1，李文燦1，陳崇偉1，李景和2

(1.株洲市中心醫院胸外科，湖南 株洲 412000；2.中南大學湘雅醫院，湖南 長沙 410000)

目的 探討化療前血漿中microRNA-21(miR-21)表達對Ⅲ期非小細胞肺癌（NSCLC)新輔助化療療效的影響以及對指導Ⅲ期肺癌患者臨床治療的意義。方法以80例確診為Ⅲ期的NSCLC患者(病例組)和30例健康志愿者(對照組)為研究對象，病例組患者化療前采取外周血標本，通過熒光定量PCR方法觀察血漿中miR-21表達與正常對照組中的表達差異；兩個周期鉑類藥物化療后觀察化療前血漿中miR-21表達與其化療療效的關系。結果病例組患者血漿中miR-21表達水平顯著高于正常對照組(P＜0.01)；病例組患者化療前血漿中miR-21在（PD+SD）組的表達量高于(CR+PR)組(P＜0.05)。結論血漿miR-21在Ⅲ期非小細胞肺癌中高表達，其表達水平與鉑類藥物化療的療效相關，提示非小細胞肺癌Ⅲ期患者化療前血漿中miR-21表達檢測可成為預測新輔助化療敏感性指標，為指導Ⅲ期肺癌患者臨床治療方案，為個體化治療提供新的思路。

Ⅲ期非小細胞肺癌；血漿miR-21；新輔助化療

肺癌是我們國家最常見的十大惡性腫瘤之一，非小細胞肺癌(NSCLC)約占肺癌的80%。肺癌的首選治療方法是手術切除，但大部分患者臨床確診時已經到了中晚期，已經不適合手術切除了。近年來對于中晚期肺癌患者采取新輔助化療得到越來越多的關注，Ⅲ期NSCLC手術前采用新輔助化療可以比較早的對腫瘤進行全身和局部控制，也可能使局部腫瘤降期從而增加手術完全切除的機會。通過分子生物學手段預測新輔助化療療效對指導臨床治療無疑具有重要意義。近幾年來對有關miRNA的研究已成為腫瘤學診斷和治療領域的新熱點，其中microRNA-21 (miR-21)在多種腫瘤細胞中的表達均出現顯著異常，miR-21抑制劑可使腫瘤細胞對放療和化療藥物的反應敏感性增加[1-2]。本研究旨在研究化療前Ⅲ期NSCLC患者血漿中miR-21表達與正常人群的差異，及其對進行鉑類藥物化療的Ⅲ期NSCLC患者近期療效的影響，以期指導臨床治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年9月至2014年4月中南大學湘雅醫院和株洲市中心醫院胸外科80例Ⅲ期NSCLC患者(病例組)，其中40例Ⅲa期，40例Ⅲb期，均經病理組織學確診。經患者同意，80例患者均行新輔助化療，手術前進行兩個療程的鉑類藥物新輔助化療，化療前采取外周血標本。兩個周期化療后進行CT或其他影象學檢查對患者進行療效評價，按照WHO推薦的實體瘤客觀療效評定標準，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩定(SD)和進展(PD)。比較(CR+PR)和(SD+PD)兩組化療前血漿miR-21表達水平的差異，探討miR-21與鉑類藥物化療敏感性的相關性。另外收集30例健康志愿者的外周血標本作為對照組。根據化療的療效來確定其是否能進行手術切除。

1.2 方法

1.2.1 血液樣本的處理 化療前常規靜脈抽取80例患者5 ml外周血，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，在常溫下4 h內處理。血標本在4℃下1 200×g離心10 min，用1.5 ml無RNase的離心管分裝血漿和血細胞，置于EP管中，隨即置于-80℃低溫冰箱存放以備用。

1.2.2 血漿總RNA提取 每份血標本取400μl血漿移至新的EP管中，提取RNA前再次離心，4°C離心10 min。按mirVana PARIS試劑盒(Ambion，USA)說明書抽提總RNA。

1.2.3 血漿miR-21檢測 首先按照上海吉瑪制藥技術有限公司Hairpin-itTM miRNAs qPCR QuantitationKit試劑盒說明進行逆轉錄反應。然后開展熒光定量PCR，對目的miRNAs使用一般通用的反轉錄條件進行轉錄。miR-21正向引物：5'-ACGTTGTGTAGCTTATCAGACTG-3'；miR-21反向引物5'-AATGGTTGTTCTCCACACTCTC-3；反應條件要求為：3 min 94℃，94℃20 s，62℃40 s，循環40次，所有標本需要檢測3次。本實驗選取miRNA-16為內對照。

1.3 統計學方法 通過2-ΔΔCt計算各組間對應基因的表達差異，△Ct為miR-21的Ct值與內參miR-16的Ct值的差值。ΔCt(NSCLC)=CtmiR-21－CtmiR-16；ΔCt(正常對照)=CtmiR-21－CtmiR-16；ΔΔCt=ΔCt(NSCLC)－ΔCt(正常對照)Mean。統計學分析以2-ΔΔCt表示miR-21表達量，對血漿miR-21相對表達量進行log10正態性轉換。用SPSS13.0統計軟件進行處理。檢驗水準α=0.05，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-21在病例組患者與正常對照組中的表達比較 Ⅲ期NSCLC患者的血漿miRNA水平顯著高于正常對照組(P＜0.01)，見圖1。

圖1 Ⅲ期NSCLC患者與對照組血漿miR-21的表達

2.2 病例組患者化療前血漿中miR-21與鉑類藥物化療療效的相關性 實時定量PCR結果分析顯示，病例組患者化療前血漿中miR-21在(PD+SD)組的表達量高于(CR+PR)組(P＜0.05)，見圖2。結果提示Ⅲ期NSCLC患者化療前血漿中miR-21的表達可能與Ⅲ期NSCLC患者對鉑類藥物的化療敏感性相關。

圖2 (CR+PR)組和(PD+SD)組血漿miR-21表達水平的差異

3 討論

肺癌是我們國家常見的十大惡性腫瘤之一，尤其是這兩年隨著我們國家環境污染，霧霾天氣在各地出現的頻率越來越高，肺癌的發病率和死亡率越來越高。非小細胞肺癌(NSCLC)約占肺癌的80%，但由于我國目前肺癌診斷水平有限，70%～80%的患者確診時已屬中晚期。Ⅲ期NSCLC是指腫瘤沒有發生遠處轉移，僅限于胸腔內的局部晚期肺癌。現在全世界有關Ⅲ期NSCLC肺癌的治療問題仍存在比較多的爭議。但近年來臨床研究發現，Ⅲ期NSCLC肺癌絕大多數還是可以手術治療的，其中相當部分患者術后可獲長期生存，其外科手術治療療效明顯優于內科保守治療，因此對有條件的這類患者臨床上還是要應力爭手術治療。

腫瘤的新輔助化療也稱術前化療，是指在惡性腫瘤局部實施手術或放療前應用的全身性化療，在局部治療前先以全身化療為第一步治療，目的在于控制原發病灶，爭取手術治療機會,并且可以抑制和殺滅隱性微轉移灶，從而提高惡性腫瘤患者的遠期生存率。臨床上越來越多針對Ⅲa期NSCLC患者先采取新輔助化療再進行手術，這已被NCCN列為標準治療；而Ⅲb期NSCLC患者可以通過新輔助化療后腫瘤降期以達到進行手術的目的。臨床上新輔助化療NSCLC首選為鉑類藥物。研究發現，新輔助化療無效的患者生存期甚至低于直接手術者，因此新輔助化療對化療有效的患者才可能受益[3]。現在很多醫院針對Ⅲ期NSCLC肺癌的治療方案為，對化療有效的患者有選擇性的進行新輔助化療，然后進行手術切除，以提高患者的生存率。若在新輔助化療前通過一些基因檢測預測新輔助化療患者的預后及療效，對實現Ⅲ期NSCLC患者的個體化治療意義重大。

miRNA是一類進化上保守內源性非蛋白質編碼的RNA分子，研究發現miR-21多種腫瘤組織中均呈過高表達[4-7]。近年來，多項研究表明在多種腫瘤中miR-21的表達與化療藥物的敏感性具有顯著相關。Schetter等[8]研究發現結腸癌中miR-21高表達與治療療效不佳、預后差顯著相關。Meng等[9]發現應用抗miR-21的AMOs(Anti-miRNA oligonucleotides)可增加膽管癌細胞對化療藥物敏感性；Li等[10]發現miR-21可用于提高惡性膠質瘤藥物治療的療效；Hwang等[11]也在體內實驗中證明反義抑制miR-21的表達可增強胰腺癌細胞對放化療的敏感性。Gao等[12]研究觀察到上調肺癌細胞A549中miR-21的表達能顯著增加對順鉑的耐藥性，國內研究[13]也發現miR-21在非小細胞肺癌(NSCLC)患者血漿中表達與NSCLC的TNM分期具有顯著相關性，并血漿miR-21的表達可能與NSCLC鉑類藥物化療敏感性相關。

我們的研究結果表明，血漿miR-21在Ⅲ期非小細胞肺癌中高表達，其表達水平與鉑類藥物化療的效果有關，提示非小細胞肺癌Ⅲ期患者化療前血漿中miR-21表達檢測可成為預測新輔助化療敏感性指標，為局部晚期非小細胞肺癌“個體化外科治療”提供新的思路。

[1]Blower PE,Chung JH,Verducci JS,et al.MicroRNAs modulate the chemosensitivity of tumor cells[J].Mol Cancer Ther,2008,7(1): 1-9.

[2]Li Y,Zhao SG,Zhen YB,et al.AmiR-21 inhibitor enhances apoptosis and reduces G2-M accumulation induced by ionizing raduation in human glioblastoma U251cells[J].Brain Tumor Pathol,2011,28 (3):209-214.

[3]彭忠民,羅 靜,王濰博,等.耐藥相關基因表達對Ⅲ期非小細胞肺癌新輔助化療的臨床預測價值探討[J].癌癥,2005,23(8): 963-967.

[4]陸 曉,孫 婧,高 雯,等.非小細胞肺癌耐藥細胞株A549/DDP中microRNA表達的初步研究[J].中華腫瘤防治雜志,2010,17 (9):659-663.

[5]Selcuklu SD,Donoghue MT,Spillane C.miR-21 as a key regulator of oncogenic processes[J].Biochem Soc Trans,2009,37(4): 918-925.

[6]鐘 琦,房居高,黃志剛,等.喉鱗狀細胞癌組織miRNA表達的初步研究[J].中華腫瘤防治雜志,2010,17(14):1073-1076.

[7]張保貴,劉炳亞,燕 敏.MiR-21與腫瘤的研究進展[J].國際外科學雜志,2011,38(4):262-267.

[8]Schetter AJ,Leung SY,Sohn JJ,et al.MiRNA expression profiles associated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma[J].JAMA,2008,299(4):425-436.

[9]Meng F,Henson R,Lang M,et al.Involvement of human micro-RNA in growth and response to chemotherapy in human cholangiocarcinoma cell lines[J].Gastroenterology,2006,130(7): 2113-2129.

[10]Li Y,Li W,Yang Y,et al.MicoRNA-21 targets LRRFIP1 and contributes to VM-26 resistance in glioblastoma multiforme[J].Brain Res,2009,1286:13-18.

[11]Hwang JH,Voortman J,Giovannetti E,et al.Identification of microRNA-21 as a biomarker for chemoresistance and clinical outcome following adjuvant therapy in resectable pancreatic cancer[J]. PLoS One,2010,5(5):e10630.

[12]Gao W,Lu X,Liu L,et al.MiRNA-21:a biomarker predictive forplatinum-based adjuvant chemotherapy response in patients with non-small cell lung cancer[J].Cancer Biol Ther,2012,13(5): 330-340.

[13]魏 娟.血漿miRNA-21與非小細胞肺癌早期診斷及鉑類藥物敏感性的相關性研究[D].南京醫科大學,2011.

Expression of plasma miR-21 in patients with NSCLC and its clinical significance.

WU Zhi-hui1,LI Wen-can1, CHEN Chong-wei1,LI Jing-he2.
1.Department of Thoracic Surgery,Zhuzhou Central Hospital,Zhuzhou 412000, Hunan,CHINA;2.Xiangya Hospital of Central South University,Changsha 410000,Hunan,CHINA

ObjectiveTo investigate the impact of the plasma miR-21 expression before chemotherapy on the curative effect of neoadjuvant chemotherapy for stageⅢnon small cell lung cancer(NSCLC),and its clinical significance as well.MethodsEighty patients with stageⅢNSCLC(case group)and 30 healthy volunteers(control group)were selected as research subjects.The peripheral blood of patients in case group were sampled before chemotherapy,and the miR-21 expression were observed by fluorescence quantitative PCR and then compared with the expression of control group.After 2 cycles of platinum drugs based chemotherapy,the correlation between the plasma miR-21 expression before chemotherapy and its chemotherapeutic effect were analyzed.ResultsThe expression of miR-21 in the plasma ofⅢNSCLC patients were significantly higher than those in control group(P＜0.01).The plasma miR-21 expression before chemotherapy in(PD+SD)group was higher than that in(CR+PR)group(P＜0.05).ConclusionThe plasma miR-21 expression is high in stageⅢ NSCLC,and its expression level is associated with the efficacy of platinum drugs based chemotherapy.Detection of plasma miR-21 expression in stageⅢNSCLC patients before chemotherapy may help predict the sensitivity of neoadjuvant chemotherapy,and then provide new ideas for clinical treatments.

StageⅢnon-small cell lung cancer;Plasma miR-21;Neoadjuvant chemotherapy

R734.2

A

1003—6350（2015）06—0803—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.06.0288

2014-08-22)

株洲市2014年度醫療衛生領域指導性科技計劃（編號：2014WY05）

吳稚暉。E-mail：530389278@qq.com