浸潤性乳腺癌、乳腺良性病變及正常乳腺組織中骨橋蛋白及相關因子的表達差異及相關性研究

杜正文，高迎飛，王玉明，李新秋，楊 梁

（湖北醫藥學院附屬人民醫院甲狀腺乳腺血管外科，湖北 十堰 442000）

浸潤性乳腺癌、乳腺良性病變及正常乳腺組織中骨橋蛋白及相關因子的表達差異及相關性研究

杜正文，高迎飛，王玉明，李新秋，楊 梁

（湖北醫藥學院附屬人民醫院甲狀腺乳腺血管外科，湖北 十堰 442000）

目的 檢測不同性質乳腺組織中骨橋蛋白(OPN)、血管內皮生長因子-C(VEGF-C)和乳腺腫瘤激酶(Brk)表達量的差異并探討其臨床意義。方法采用免疫組織化學染色法檢測92例浸潤性乳腺癌組織、60例乳腺良性病變組織和35例正常乳腺組織中OPN、VEGF-C和Brk的表達情況，比較分析其與臨床病理學因素之間的相關性。結果三種蛋白OPN、VEGF-C和Brk在浸潤性乳腺癌組織中均呈現出較高的表達，陽性表達率分別為66.3%、56.5%和70.7%，與乳腺良性病變以及正常乳腺組織比較差異均具有顯著統計學意義(P＜0.01)。OPN、Brk表達與患者年齡、腫瘤直徑以及組織病理學分級無關(P＞0.05)，而與淋巴結轉移及TNM分期有關(P＜0.05)；而VEGF-C表達與患者年齡、腫瘤直徑無關(P＞0.05)，與組織病理學分級、淋巴結轉移及TNM分期有關(P＜0.05)。乳腺癌組織中的OPN、VEGF-C和Brk表達兩兩之間呈正相關性(P＜0.05)，而在正常乳腺組織和良性病變組織中三者之間無明顯相關性(P＞0.05)。結論在正常乳腺組織、良性病變組織和乳腺癌組織中，OPN、Brk與VEGF-C的表達量均依次升高。OPN可能通過介導VEGF-C蛋白刺激內皮細胞黏附和遷移而加速血管形成，通過參與新血管生成和腫瘤的侵襲進而與淋巴結轉移有關，三者的表達量均與腫瘤分期、淋巴結轉移等臨床病理因素有不同程度的相關。

乳腺腫瘤；骨橋蛋白；血管內皮生長因子C；免疫組織化學

乳腺癌(Mammary cancer)是女性中最常見的高發性惡性腫瘤，通常發生于乳房腺上皮組織右上象限，其發病率約占各種惡性腫瘤的10%，已成為威脅婦女健康的主要病因，受到全球醫學界的廣泛關注。骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)是一種與惡性轉化相關的蛋白，最早發現于牙齒和骨基質中，是細胞在骨基質中的產物，具有骨特異性，因其是細胞在骨基質中的產物，并能在骨組織細胞與基質中的礦質形成一種橋連，人們將其命名為OPN[2-3]。乳腺腫瘤血管生成一直被認為在腫瘤生長，存活以及轉移的過程中起到至關重要的作用。大量研究證明，血管內皮生長因子C(Vascular endothelial growth factor C，VEGF-C)是最為典型的促血管生成影響因素。研究發現，OPN可能通過乳腺腫瘤激酶(Breast tumor kinase，Brk)、VEGF-C蛋白刺激內皮細胞附著和遷移而作用于腫瘤血管生成，并與腫瘤的侵襲和轉移相關。本研究采用免疫組化SP方法，對OPN、Brk和VEGF-C三種腫瘤相關蛋白分別在乳腺癌、良性病變及正常乳腺組織中表達量的差異情況進行對比研究并分析這些蛋白與臨床病理學因素之間是否存在相關性，進而探討OPN、Brk和VEGF-C三種蛋白在浸潤性乳腺癌發生與發展過程中所起的作用[4]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院乳腺外科2011年1月至2013年12月92例浸潤性乳腺癌手術切除組織，60例良性病變組織和35例正常乳腺組織。乳腺癌患者包括浸潤性小葉癌19例，浸潤性導管癌73例；年齡25～71歲，平均46歲。所有患者術前均無化療或放療史及其他手術史。

1.2 試劑 小鼠抗人OPN單克隆抗體、小鼠抗人VEGF-C單克隆抗體、兔抗人Brk多克隆抗體(均購自美國Santa Cruz公司)；SP免疫組織化學試劑盒(購自中國福州邁新公司)。

1.3 方法 采用免疫組織化學SP(Streptavidin-peroxidase)法檢測，切除的組織標本經4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，5 μm連續切片4片行免疫組化染色(OPN與VEGF-C蛋白各兩片)。步驟如下，二甲苯脫蠟、乙醇梯度脫水，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次×5 min；3%H2O2(80%甲醇)室溫處理切片15 min，PBS洗3次×5 min；抗原修復，PBS洗3次×5 min；10%山羊血清封閉液室溫封閉孵育30 min；棄封閉液后抗體孵育：按工作濃度加相應一抗工作液，37℃孵育60 min，PBS洗3次×5 min；滴加SP復合物，在37℃恒溫箱孵育30 min，PBS洗3次×5 min；新鮮配制的DAB-H2O2顯色液孵育5～10 min，在顯微鏡下觀察判斷好染色程度；自來水沖洗5 min后用蘇木精復染2 min，鹽酸酒精分化，自來水再沖洗5～10 min，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察。

1.4 結果判定 OPN、Brk和VEGF-C蛋白陽性表達均定位于細胞漿呈淡黃或棕黃色彌散性染色，每張組織標本切片隨機選取5個高倍鏡下視野(×400)，分別計算各自的陽性表達細胞百分比，陽性細胞數＜10%者計為陰性結果，≥10%者計為陽性結果。

1.5 統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件進行數據處理。陽性表達率各組間的比較采用χ2檢驗；相關性檢測用Spearman相關檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OPN、Brk和VEGF-C蛋白在良、惡性及正常乳腺組織中的表達情況 OPN、Brk和VEGF-C蛋白陽性表達均為彌散性細胞漿染色。乳腺癌組織、乳腺良性病變組織及正常乳腺組織中OPN、Brk和VEGF-C蛋白的陽性表達率均呈依次降低，各蛋白三組間同時比較，差異均具有顯著統計學意義(P＜0.01)，見表1。

表1 OPN、Brk和VEGF-C蛋白在不同乳腺(病變)組織中的表達

2.2 浸潤性乳腺癌組織中的OPN、Brk和VEGF-C表達與臨床病理因素的關系 在乳腺癌組織中，OPN和Brk的表達量與患者的年齡、腫瘤直徑大小及組織學分級無關(P＞0.05)，僅與淋巴結轉移及TNM分期有關(P＜0.05)，并且表達水平與TNM分期呈正相關，即表達水平越高，TNM分期越晚；而VEGF-C蛋白表達與患者的年齡及腫瘤直徑大小無關(P＞0.05)，與組織學分級、淋巴結轉移及TNM分期相關(P＜0.05)，見表2。

2.3 OPN、Brk和VEGF-C蛋白在不同組織中表達的相關性分析 OPN、Brk和VEGF-C蛋白在乳腺癌組織中的表達兩兩呈正相關(P＜0.05)，而在乳腺良性病變組織和正常乳腺組織中的表達則無明顯相關性(P＞0.05)，見表3。

表2 浸潤性乳腺癌組織中OPN、VEGF-C及Brk陽性表達與臨床病理學因素的相關性

表3 乳腺癌組織中VEGF-C表達和臨床病理因素間的相關性

3 討論

腫瘤細胞的擴散與轉移是引起乳腺癌死亡的主要原因，乳腺癌一旦發生轉移，則會導致患者的生存機率明顯降低。因此，提高浸潤性乳腺癌患者治愈率和生存率的主要路徑就是減少腫瘤細胞的擴散與轉移。相關研究表明，OPN蛋白具備明顯促進腫瘤惡化傾向的能力，在一些領域內被認定為惡性腫瘤生長的標志。OPN蛋白在組織中不同水平的表達與機體的反應顯著相關，尤其對于感染和創傷的反應方面，在長期的臨場實踐中也證實了OPN與胃癌、前列腺癌、動脈粥樣硬化斑塊形成等病理過程密切相關。值得注意的是，OPN蛋白甚至可以全程參與腫瘤的發生發展的過程，在腫瘤細胞轉移過程中發揮著不可替代的作用，OPN在機體中的陽性表達已經成為確定腫瘤轉移的一個“金標準”，腫瘤轉移患者血清中通常可檢出OPN蛋白水平明顯增高[5]。與前人的研究結果一致，我們的研究結果揭示了OPN在不同組織間表達相差較大：在浸潤性乳腺癌組織中表達較高，而在乳腺良性病變組織以及正常乳腺組織細胞中表達較少，提示OPN蛋白參與到了浸潤性乳腺癌淋巴管生成以及淋巴結轉移的過程。

淋巴系統轉移是乳腺癌轉移過程中最常見的轉移方式。OPN、VEGF、Brk三種蛋白在腫瘤組織發生發展中所扮演的角色尚不確切，近期研究表明，OPN主要參與腫瘤組織微小血管的生成過程，可能借助VEGF、Brk的生理作用刺激內皮細胞粘附和轉移而加速新血管形成，從而促進腫瘤組織隨著新生血管侵襲和轉移。近年來發現的VEGF-C蛋白，作為VEGF基因家族的“明星”蛋白，更多的研究者在關注VEGF-C蛋白，因為其在腫瘤轉移過程發揮關鍵性作用，可促進新的血管和淋巴管生成，極大改變淋巴管管壁的通透性，為腫瘤組織侵襲提供了有利的微環境，因此VEGF-C在乳腺癌淋巴系統轉移中發揮至關重要的作用[6]。我們的研究結果表明VEGF-C僅在浸潤性乳腺癌組織中表達較高，而在乳腺良性病變組織以及正常乳腺組織細胞中僅少量表達甚至幾乎不表達，這說明VEGF-C蛋白在浸潤性乳癌的形成中發揮了不可忽視的作用。值得一提的是，國內外相關研究與我們的結果也相符，洪勇等[7]檢測三陰性和非三陰性乳腺癌組織中VEGF-C的表達量情況，發現VEGF-C在這兩種乳腺癌中均呈陽性表達，其表達率均顯著高于良性乳腺病變組織和正常乳腺組織，具有統計學意義；Kinoshita等[8]發現乳腺癌組織中VEGF-C蛋白陽性表達與癌組織淋巴管浸潤顯著相關，且檢出VEGF-C陽性患者5年RFS指標均低于VEFG-C蛋白表達陰性的患者；Nakamura等[9]進一步研究發現，VEGF-C蛋白在乳腺癌組織中的表達與淋巴管密度及淋巴結轉移數目有相關性。而沉默VEGF-C基因的表達對腫瘤生長與轉移具有消極作用，會導致乳腺癌細胞的侵襲能力、腫瘤的生長速度、淋巴管生成及淋巴系統轉移率等不同程度的降低[10]。研究表明，VEGF-C蛋白的表達水平與行新輔助化療患者的預后密切相關，可作為晚期乳腺癌患者行新輔助化療后的愈后預測因素[11-12]。Garmy-Susini等[13]發現VEGF-C可以通過整合素α4β1激活淋巴管內皮細胞或其受體來促進腫瘤的淋巴結轉移，但其具體的作用機制尚不明確。近年研究發現生存素及細胞外基質蛋白1(ECM1)與VEGF-C在乳腺癌組織中的表達呈正相關，共同表達于乳腺癌組織[14-15]。VEGF-C的表達和分泌受多種因素，比如炎性因子的調節，但是這些因素對VEGF-C的表達和分泌的機制尚不明了，在將來的研究中，筆者將從炎性細胞因子網絡和VEGF-C、OPN以及Brk之間相互作用方面來探討乳腺癌發生發展的作用機制。此外，基于VEGF-C、OPN以及Brk蛋白，利用rRNA干擾技術或基因敲除技術做進一步的研究和炎癥，將對揭示乳腺癌組織浸潤和轉移提供重要的科研證據。因為研究上述因子之間的調控機制，尋找新的治療靶點，研究新的治療方法，積極預防乳腺癌的遠處轉移，對乳腺癌患者的治療及延長患者壽命都具有重要的意義。

本文研究結果表明，在浸潤性乳腺癌組織中OPN、Brk和VEGF-C蛋白表達之間存在兩兩相關性(P＜0.05)，說明OPN可能作為上游基因通過影響Brk和VEGF-C等或其受體參與腫瘤，尤其是乳腺腫瘤的發生和轉移，而在良性乳腺病變組織和正常乳腺組織中OPN、Brk和VEGF-C表達之間則沒有體現出相關性(P＞0.05)，也從側面說明了OPN對于腫瘤發生與轉移的具體涵義，但具體的機制有待進一步的研究。此外我們發現，三者在乳腺癌組織、乳腺良性病變組織和正常乳腺組織中表達陽性率的逐級遞減的規律，即在癌組織中高表達，在正常組織幾乎不表達，這種變化趨勢也證實了這些因素在乳腺癌發生、發展中起到了至關重要的作用，且與浸潤性乳腺癌的侵襲性呈正相關，以此可探索新的診斷乳腺癌，尤其是乳腺癌是否有淋巴管轉移的重要標準，也可作為判斷乳腺癌預后的重要指標。

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Differential expression of osteopontin and related factors in invasive breast cancer,benign breast lesion, normal breast tissues and correlation analysis.

DU Zheng-wen,GAO Ying-fei,WANG Yu-ming,LI Xin-qiu,YANG Liang.
Department of Vascular,Thyroid,and Breast Surgery,the People's Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo detect the differential expression of osteopontin(OPN),vascular endothelial growth factor C(VEGF-C)and breast tumor kinase(Brk)in different breast tissue types,and to evaluate its clinical significance.MethodsImmunohistochemical staining was applied to detect the expression of OPN,VEGF-C and Brk in 92 cases of invasive breast cancer,60 cases of benign breast lesions and 35 cases of normal breast tissue. Their correlation with clinicopathological factors were compared and analyzed.ResultsOPN,VEGF-C and Brk proteins in invasive breast cancer all showed high positive expression rates of 66.3%,56.5%and 70.7%,respectively, which had statistically significant difference with those in benign breast lesions and normal breast tissue(P＜0.01). The expressions of OPN,Brk showed no correlation with age,tumor size and histological grade(P＞0.05),but were correlated with lymph node metastasis and TNM stage(P＜0.05).VEGF-C expression were correlated to histopathologic grade,lymph node metastasis and TNM stage(P＜0.05),but not with age,tumor size(P＞0.05).In breast cancer, there was positive correlation between the expression of OPN,VEGF-C and Brk(P＜0.05),no with no significant correlation in normal breast tissue and benign breast lesions(P＞0.05).ConclusionIn normal breast tissue,benign breast lesions and breast cancer,the expression levels of OPN,Brk and VEGF-C increase successively.OPN, through mediating VEGF-C,may stimulate endothelial cell adhesion and migration to accelerate angiogenesis.It is involved in angiogenesis and tumor invasion and thus correlated with lymph node metastasis.The expression levels of OPN,Brk and VEGF-C are correlated to clinical pathological factors of tumor stage,lymph node metastasis to different extents.

Breast cancer;Osteopontin;Vascular endothelial growth factor C;Immunohistochemistry

R737.9

A

1003—6350（2015）06—0806—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.06.0289

2014-08-19)

高迎飛。E-mail：2118wy@126.com