Ranibizumab抑制堿燒傷誘導小鼠角膜新生血管作用觀察

張 婷，馬曉昀，張 昀，劉 林，丁雯芝，鄒 俊，

(1.上海交通大學附屬第六人民醫院眼科，上海 200233；2.上海市光華中西醫結合醫院，上海 200052；3.上海市第十人民醫院眼科，上海 200072)

Ranibizumab抑制堿燒傷誘導小鼠角膜新生血管作用觀察

張 婷1，馬曉昀2，張 昀2，劉 林3，丁雯芝1，鄒 俊1，3

(1.上海交通大學附屬第六人民醫院眼科，上海 200233；2.上海市光華中西醫結合醫院，上海 200052；3.上海市第十人民醫院眼科，上海 200072)

目的 觀察雷尼單抗(Ranibizumab)抑制堿燒傷誘導小鼠角膜新生血管(CorNV)的作用。方法取清潔級BALB/c小鼠36只，將加有NaOH溶液(1 mol/L)的直徑2 mm圓形濾紙片輕貼角膜中央燒灼30 s，制備角膜堿燒傷CorNV模型：右眼接受堿燒傷處理，左眼不予處理。后隨機將小鼠分為兩組，于堿燒傷后2 d、8 d時右眼分別行球結膜下注射0.9%生理鹽水(陰性對照組，18只小鼠)、10 mg/ml Ranibizumab(Ranibizumab治療組，18只小鼠)。堿燒傷后4 d、7d、14 d時行眼前節照相大體觀察CorNV生長變化并計算CorNV面積；分別于堿燒傷后7 d、14 d時行蘇木素-伊紅(HE)染色觀察角膜組織病理結構及CorNV變化；免疫組織化學(IHC)染色檢測角膜HIF-1α、VEGF-A蛋白表達；實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time PCR)檢測角膜HIF-1αmRNA、VEGF-A mRNA表達。結果眼前節照相、HE染色結果顯示：堿燒傷后7 d、14 d時Ranibizumab治療組較陰性對照組角膜新生血管減少，細小稀疏，CorNV面積明顯減小，差異均有統計學意義(P＜0.05)。PCR結果顯示：Ranibizumab治療組中角膜VEGF-AmRNA相對表達于7 d、14 d時均較陰性對照組降低，7 d時HIF-1αmRNA相對表達降低；差異均有統計學意義(P＜0.05)。免疫組化結果顯示：Ranibizumab治療組VEGF-A蛋白表達于7 d、14 d時較陰性對照組均降低，差異均有統計學意義(P＜0.05)；HIF-1α表達未明顯改變。結論Lucentis通過下調VEGF對堿燒傷誘導小鼠角膜CorNV具有一定抑制作用。

角膜新生血管；堿燒傷；雷尼單抗；低氧誘導因子-1α；血管內皮生長因子

角膜結構無血管特性是保證角膜透明和良好視力的前提[1]。角膜主要依靠其特殊的免疫赦免優勢機制維持角膜無血管[2-3]。膜新生血管(Corneal neovascularization，CorNV)是繼發于炎癥、低氧、外傷等病理性條件的常見眼部并發癥，可不同程度影響視力[1]。臨床常規治療CorNV因局限性較多、療效不佳而無統一有效治療方案，故積極探索新的治療途徑十分必要[4]。角膜中HIF-1α/VEGF通路堿燒傷誘導CorNV中起著重要作用[5]。本研究試圖觀察Ranibizumab在堿燒傷誘導小鼠CorNV模型中療效及HIF-1α、VEGF表達變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6～8周齡的清潔級BALB/c小鼠36只(體重18～20 g，雌雄不限)。實驗動物于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司購入，于上海交通大學附屬第六人民醫院動物實驗室統一飼養。動物生產許可證號為[SCXK(滬)2008-0016]，使用許可證號為[SYXK(滬)2011-0128]。嚴格遵循《動物實驗管理條例》進行動物實驗。實驗前排除角膜新生血管、混濁等角膜疾患。

1.1.2 主要試劑 鹽酸丙美卡因滴眼液(美國Alcon公司)；Ranibizumab試劑(美國Genentech公司)；兔抗人HIF-1α、VEGF-A多克隆抗體、羊抗兔IgG抗體、HIF-1α、VEGF-A、GAPDH引物序列(上海生工生物工程股份有限公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR)逆轉錄試劑盒及聚合酶鏈反應試劑盒(日本Takara公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立 實驗前腹腔注射戊巴比妥麻醉小鼠，右眼予點滴0.5%鹽酸丙美卡因表面麻醉。向單層圓形濾紙(直徑2 mm)加入1 μl NaOH溶液(1 mol/L)，手術顯微鏡下將濾紙輕輕貼附于小鼠右眼角膜中央，燒灼30 s，后立即用0.9%生理鹽水充分沖洗眼表、眼瞼等位置1 min，建立堿燒傷誘導小鼠CorNV模型，左眼不予處理。術后鹽酸林可霉素滴眼預防感染。

1.2.2 實驗分組及球結膜下注射 將上述動物隨機分為2組，每組18只小鼠，分別于堿燒傷后2 d、8 d時使用微量進樣器(上海光正醫療儀器有限公司)距小鼠右眼角膜緣0.5～1 mm處行球結膜下注射：(1)陰性對照組：10 μl 0.9%生理鹽水；(2)Ranibizumab治療組：10 μl Ranibizumab(10 mg/ml)。注射后點滴鹽酸林可霉素。

1.2.3 CorNV形態學觀察 每日觀察堿燒傷后CorNV生長情況。于堿燒傷后4 d、7 d、14 d進行眼前節照相，通過Image-Pro Plus 6.0(IPP 6.0)圖像分析軟件測量CorNV長度，自角膜緣向中央長入的最長、彎曲度小的新生血管納入測量范圍，根據面積(A)計算公式A=C/12×3.1416[r2-(r-l)2][6]計算CorNV面積，C為新生血管累及的角膜圓周鐘點數，小鼠角膜半徑r=1.5 mm，l為所測量的新生血管長度。

1.2.4 蘇木素-伊紅染色和免疫組織化學染色 堿燒傷后7 d、14 d各隨機處死3只小鼠，摘除眼球制作石蠟切片，4 μm連續切片。隨機取3張切片行HE染色，光學顯微鏡下觀察堿燒傷后CorNV生長、角膜組織病理結構改變，每張切片在×200倍顯微鏡視野下隨機選取3個視野照相。隨機取3張切片行IHC染色。切片經抗原修復、10%山羊血清封閉等。加入兔抗人HIF-1α、VEGF-A多克隆抗體(稀釋度均為1: 150)，4℃過夜。羊抗兔IgG抗體孵育后經二氨基聯苯胺顯色。每張切片在×200倍視野下隨機選取3個視野照相，運用IPP 6.0軟件對角膜HIF-1α、VEGF-A染色進行積分光密度(Integral optical density，IOD)分析，IOD值代表照片中蛋白表達總量。

1.2.5 Real-time PCR 堿燒傷后7 d、14 d各隨機處死3只小鼠，提取角膜組織總RNA后將其逆轉錄為cDNA。使用SYBR GREEN法行PCR反應檢測HIF-1αmRNA、VEGF-A mRNA表達。GAPDH作為HIF-1α和VEGF-A內參。角膜HIF-1αmRNA、VEGF-A mRNA相對表達量計算應用2-△△Ct方法。此實驗重復2次。

HIF-1α引物序列：上游5'-ACTGCCACCACTGATGAATCAAAAACAG-3'；下游5'-TTCCATTTTT CGCTTCCTCTGAGCATTC-3'；VEGF-A引物序列：上 游 5'-CCTTCGTCCTCTCCTTACCC-3'，下 游5'-AAGCCACTCACACACACAGC-3'；GAPDH引物序列：上游5'-GACTTCAACAGCAACTCCCAC-3'，下游5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，。

1.3 統計學方法 兩組的CorNV面積、角膜HIF-1αmRNA和VEGF-A mRNA相對表達值、角膜HIF-1α和VEGF-A染色的IOD值以均數±標準差(±s)表示，采用SPSS13.0軟件對所有數據進行獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠角膜堿燒傷后CorNV形成觀察

2.1.1 形態學觀察 堿燒傷后2 d時兩組角膜均水腫，未見明顯CorNV。4 d時兩組CorNV面積大小差異無統計學意義。7 d時新生血管尖端出現分叉且部分交織吻合，14 d時新生血管較7 d時更趨向角膜中央，生長旺盛且面積增大。7 d、14 d時Ranibizumab治療組面積較陰性對照組減小，差異均具有統計學意義(P＜0.05)，新生血管較陰性對照組明顯稀疏、變短，見圖1、表1。

圖1 小鼠角膜堿燒傷后眼前節照相

表1 小鼠角膜堿燒傷后角膜新生血管面積(±s，mm2，n=6)

表1 小鼠角膜堿燒傷后角膜新生血管面積(±s，mm2，n=6)

陰性對照組Ranibizumab治療組t值P值1.27±0.09 1.07±0.09 1.58＞0.05 3.28±0.23 2.48±0.15 2.97＜0.05 4.41±0.15 3.29±0.22 4.20＜0.01

2.1.2 組織病理學觀察 HE染色下發現堿燒傷后7 d、14 d時兩組小鼠角膜上皮層均有不同程度萎縮變薄、角膜仍水腫；Ranibizumab治療組較陰性對照組新生血管減少且細小、分叉減少，更接近于角膜緣位置。14 d時，兩組新生血管生長趨勢較7 d時接近角膜中央、數量增加，見圖2。

2.2 小鼠角膜HIF-1α、VEGF表達 堿燒傷后7 d時Ranibizumab治療組HIF-1αmRNA表達較陰性對照組下調(P＜0.05)，而14 d時HIF-1αmRNA表達與陰性對照組差異無統計學意義(P＞0.05)。7 d、14 d時Ranibizumab治療組VEGF-A mRNA表達均較陰性對照組下調(P＜0.01)，見圖3。

圖2 小鼠角膜堿燒傷后7 d(A)、14 d(B)時角膜HE染色(×100)(比例尺=20μm)

圖3 小鼠角膜堿燒傷后角膜HIF-1α mRNA(A)和VEGF-A mRNA(B)相對表達值

HIF-1α主要在胞核和胞質中表達，VEGF主要在胞質和胞膜中表達。堿燒傷后陰性對照組組可見HIF-1α和VEGF陽性表達主要見于角膜上皮層、新生血管區，呈棕色或棕黃色。堿燒傷后7 d、 14 d時Ranibizumab治療組VEGF-A蛋白表達較陰性對照組降低，差異均有統計學意義(P＜0.01)，而兩組HIF-1α蛋白表達均差異無統計學意義(P＞0.05)，見圖4、表2。

圖4 小鼠角膜堿燒傷后7 d、14 d時角膜IHC染色

表2 小鼠角膜堿燒傷后角膜HIF-1α和VEGF-A表達積分光密度值(±s)

表2 小鼠角膜堿燒傷后角膜HIF-1α和VEGF-A表達積分光密度值(±s)

組別HIF-1αVEGF-A陰性對照組Ranibizumab治療組t值P值7 d 6087.00±599.30 4363.00±452.10 2.30＞0.05 14 d 5488.00±651.80 3583.00±462.90 2.38＞0.05 7 d 13515.00±1480.00 5256.00±453.20 5.33＜0.01 14 d 10464.00±757.20 2845.00±219.10 9.67＜0.01

3 討論

角膜是位于眼球外壁前段1/6的透明組織。角膜外傷、感染、低氧等病理性因素可使維持正常角膜透明無血管的特殊免疫赦免狀態遭到破壞，導致新生血管自角膜緣長入角膜形成CorNV[2-3]。目前CorNV病理機制復雜且不明確，臨床缺乏統一、有效的CorNV治療方案，故探究其發生機制對CorNV相關疾病進行預防和治療非常重要。

CorNV是多種角膜病變的共同病理現象，可不同程度影響視力甚至導致失明，也是角膜移植手術后發生排斥反應的高危因素[7]。眼部燒傷約占整個眼外傷的18%，眼燒傷80%多為化學試劑引起，可導致角膜穿孔、纖維化、血管新生和眼瞼粘連等[7-8]。因此本實驗采用堿燒傷角膜誘導CorNV模型進行機制研究，其操作簡便、成熟且具有臨床意義[9]。實驗過程未發生堿燒傷引起角膜混濁、潰瘍、穿孔等情況。

臨床用于治療CorNV的藥物如皮質激素和非甾體類抗炎藥，易引起白內障、眼壓升高、角膜變薄等；激光光凝法可引起虹膜萎縮、壞死性鞏膜炎、角膜出血和變薄等；而光動力學療法雖然效果較好但代價大限制了其應用；眼表重建術和角膜移植術不僅難度大，而且可能引起一些術后并發癥等[7]。盡管CorNV治療手段很多，但目前臨床上仍缺乏統一、有效治療方案。

VEGF已知是新生血管的重要調控因子，臨床常規使用的抗VEGF藥物主要有Ranibizumab(商品名Lucentis)等[7]。Ranibizumab等VEGF抗體可用于臨床治療脈絡膜視網膜新生血管等疾病[10]。Ranibizumab是一種來自于人源化抗VEGF抗體的抗原結合片段，可與VEGF-A各亞型特異性結合并抑制其活性，具有較高的角膜效率穿透和與VEGF-A結合力[7]。VEGF-A是VEGF家族中最重要的成員，與病理性新生血管關系最密切[7]。諸多動物研究[11-12]表明Ranibizumab通過抑制VEGF表達可有效抑制CorNV生長。目前，Ranibizumab是否可應用于人CorNV治療尚不明確，因而本研究試圖觀察Ranibizumab對堿燒傷誘導小鼠CorNV發生發展的作用。本實驗發現14 d時兩組CorNV較7 d時更趨向角膜中央、面積均增大；7 d、14 d時形態學檢測發現Ranibizumab組面積均較生理鹽水組減小、新生血管較稀疏、變短，病理學檢測發現Ranibizumab組較生理鹽水組新生血管減少且細小、分叉減少，更接近于角膜緣位置。結果提示Ranibizumab對堿燒傷誘導小鼠CorNV具有一定抑制作用。

HIF-1是缺氧條件下產生的一種重要的異二聚體轉錄因子，由兩個亞基組成：HIF-1α和HIF-1β[13]。HIF-1α是HIF-1的活性形式，正常氧環境中因可被迅速降解而幾乎檢測不到HIF-1α蛋白表達，是主要的氧調節因子，可調節多種靶基因如VEGF、葡萄糖轉運因子等表達，對維持腫瘤能量代謝、增殖和遷移，刺激血管新生等發揮重要作用[13]。同時，本研究發現與生理鹽水組比較，7 d、14 d時Ranibizumab組CorNV減輕同時伴有VEGF-A(mRNA和蛋白)表達減少，提示Ranibizumab可通過直接阻斷VEGF-A抑制CorNV。HIF-1α可通過上調VEGF受體表達起促血管新生作用[14]。本實驗中我們還發現Ranibizumab組于7 d時HIF-1αmRNA表達下調，提示Ranibizumab可能對HIF-1α也有作用，推測可能由于Ranibizumab治療后CorNV減輕，某(些)上游調控因子受調控從而抑制HIF-1α表達，表達下調的VEGF部分可能源自HIF-1α靶向抑制，目前尚不明確需進一步證明。

CorNV病理機制不明確、臨床尚缺乏有效治療，本研究發現Ranibizumab可通過下調VEGF表達從而有效抑制堿燒傷誘導小鼠CorNV，為臨床治療CorNV提供可能的新途徑。

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Inhibition effect of Ranibizumab on alkali burn induced-corneal neovascularization in mice.

ZHANG Ting1,MA Xiao-yun2,ZHANG Yun2,LIU Lin3,DING Wen-zhi1,ZOU Jun1,3.1.Department of Ophthalmology,Shanghai Sixth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200233,CHINA;2.Shanghai Guanghua Hospital of Integrative Medicine,Shanghai 200052,CHINA;3.Department of Ophthalmology,Shanghai Tenth People's Hospital, Shanghai 200072,CHINA

ObjectiveTo observe the inhibition effect of Ranibizumab on alkali burn induced-corneal neovascularization(CorNV)in mice.MethodsThirty-six healthy BALB/c mice received 1 mol/L NaOH for 30 s to establish models of alkali induced-CorNV of the right eyes.All the mice were randomly divided into two groups, negative control group(eighteen cases,the right eyes received subconjuctival injections of 0.9%normal saline),Ranibizumab treatment group(eighteen cases,the right eyes received subconjuctival injections of 10 mg/ml Ranibizumab).On days 2,8 after alkali burn,CorNV was observed and photographed on days 4,7,14.The areas of CorNV were calculated.On days 7,14,hematoxylin-eosin(HE)and immunohistochemical(IHC)staining were conducted to observe histopathological change and to detect corneal hypoxia-inducible factor-1α(HIF-1α)and vascular endothelial growth factor(VEGF)expression.Quantitative real-time polymerase chain reaction(real-time PCR) was applied to detect the expression of HIF-1αmRNA and VEGF-A mRNA.ResultsFrontal section photograph and HE staining revealed that on days 7 and 14 after alkali burn,areas of CorNV in Ranibizumab treatment group were significantly lower than that in negative control group(P＜0.05).Real-time PCR showed that relative expression levels of VEGF-A mRNA in Ranibizumab treatment group were all significantly lower than negative control group on day 7 and day 14 after alkali burn,and relative expression levels of HIF-1αmRNA were lower than negative control group on day 7(allP＜0.05).IHC staining revealed that on days 7 and 14 after alkali burn,VEGF-A pro-tein expression in Ranibizumab treatment group decreased compared to negative control group(P＜0.05),while HIF-1αprotein expression did not show any significant change.ConclusionRanibizumab has some inhibition effect on mouse CorNV induced by alkali burn through down-regulation of VEGF.

Corneal neovascularization;Alkali burn;Ranibizumab;Hypoxia-inducible factor-1α(HIF-1α); Vascular endothelial growth factor(VEGF)

R-332

A

1003—6350（2015）19—2813—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.19.1027

2015-04-15)

上海市科技委員會基金(編號：11JC1401202)

張 婷。E-mail：crystalzhang89@163.com