動脈粥樣硬化進程中單核/巨噬細胞IL-1、IL-6的表達

劉艷紅

(武漢大學人民醫院檢驗科，湖北 武漢 430060)

動脈粥樣硬化進程中單核/巨噬細胞IL-1、IL-6的表達

劉艷紅

(武漢大學人民醫院檢驗科，湖北 武漢 430060)

目的 探索脂多糖的作用下單核/巨噬細胞產生的炎癥因子與急性冠脈綜合征病程的內在關聯。方法體外培養人急性單核細胞白血病細胞(THP-1)，實驗組加脂多糖，對照組空白，按一定的時間間隔取一定體積培養液，用ELISA檢測IL-1β、IL-6、IL-1α濃度，觀測其變化情況及何時達到峰值。并對出現峰值最早的IL-1β進行實時定量PCR檢測。結果ELISA顯示，隨著培養時間的延長，濃度也發生相應的改變，IL-1β在3時達到峰值，IL-6在16時達到峰值，IL-1α在18時達到峰值。實驗組與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。結論脂多糖影響巨噬細胞IL-1β、IL-6、IL-1α的表達；達到峰值的時間不同，說明IL-1α、IL-1β、IL-6可能在不同的時間起主導作用。

白介素-1β；白介素-6；白介素-1α；脂多糖；動脈粥樣硬化

急性冠脈綜合征(Acute coronary syndrome，ACS)主要是由于動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)導致的心血管疾病，近年來已發展成為危及人類健康的主要疾病之一[1]。近10多年的研究成果已經證實AS是血管壁的慢性炎癥過程，炎癥反應貫穿其發生、發展和預后。大量的單核/巨噬細胞經趨化因子誘導出現在不穩定的粥樣斑塊內，激活后可產生多種蛋白酶，降解破壞細胞外基質成分，同時可分泌多種炎性因子，如IL-1α、IL-1β、IL-6等[2]，它們通過影響血管內皮細胞、平滑肌細胞以及巨噬細胞自身在AS和ACS發病中起一定作用，我們探討炎癥性細胞因子IL-1α、IL-1β、IL-6在脂多糖(LPS)誘導的人單核/巨噬細胞中產生的變化，從而揭示其在AS病程中可能的相互關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 THP-1細胞系(本實驗室保存)；LPS試劑購自Sigma公司；1640培養基和胎牛血清(美國Gibco公司)；IL-1α的ELISA試劑盒(產品編號EK0410)，IL-1β的ELISA試劑盒(產品編號EK0389)，IL-6的ELISA試劑盒(產品編號EK 0392)均由武漢博士德生物工程有限公司提供。凝膠成像掃描系統(美國Bio-Rad公司)；UV-265紫外可見分光光度計(日本島津)；PCR儀(PTC-225，MJ research公司)；熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 用含抗生素的1640培養基培養細胞，培養基中含10%胎牛血清。飽和濕度及5% CO2條件下進行細胞傳代培養。

1.2.2 LPS處理THP-1細胞 待細胞培養密度到85%以上，等體積無血清的培養基同步化細胞2 h，用1%血清的低營養培養基2 ml重懸細胞，并加入LPS(終濃度為10 ng/ml)，置培養箱孵育，分別在0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h、11 h、12 h收集培養基，放入對應EP管，4℃凍存待測IL-1β；分別在0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、16 h、17 h、18 h、19 h、20 h、21 h、22 h、23 h、24 h、25 h收集培養基，放入對應EP管，4℃凍存待測IL-1α和IL-6。分別于0 h、1 h、2 h、4 h收集細胞，實時定量檢測IL-1β的表達。

1.2.3 ELISA法測IL-1、IL-6濃度 按照試劑盒說明書檢測樣本IL-1、IL-6濃度。

1.2.4 實時定量PCR檢測IL-1β的表達 提取總RNA，內參18SrRNA上游引物為5'-CGGCTACCA CATCCAAGGAA-3'，下游引物為5'-GCTGGAATTA CCGCGGCT-3'；目的基因 IL-1β上游引物為5'-AATGATGGCTTATTACAGTGGCA-3'，下游引物5'-GCTGTAGTGGTGGTCGGAGATT-3'。配制實時定量逆轉錄PCR反應液：SYBR Premix ExTaq(2×) 12.5 μl，上游引物(20 μmol/L)1 μl，下游引物(20 μmol/L) 1 μl，逆轉錄產物2 μl，加滅菌蒸餾水至總體積至25 μl。PCR擴增條件為：IL-1β95℃預變性3 min，然后95℃30 s、63℃30 s、72℃30 s，40個循環；內參18 s rRNA 95℃預變性3 min，然后95℃30 s、58℃30 s、72℃30 s，40個循環。結果處理：相對定量2-ΔΔCt法，ΔCt(實驗組)=Ct(實驗組目的基因)-Ct(實驗組內參基因)，ΔCt (對照組)=Ct(對照組目的基因)-Ct(對照組內參基因)，ΔΔCt=ΔCt(實驗組)-ΔCt(對照組)，表達倍數=2-ΔΔCt。

1.3 統計學方法 應用統計分析軟件Graph-PadPrism5版對實時定量PCR結果進行統計學分析。每組實驗重復3次，每次實驗有3個重復值。計量數據以均數±標準差(±s)表示，兩組間均數的比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ELISA檢測IL-1β濃度的時間曲線 LPS作用THP-1細胞后，按照一定的時間收集培養基，使用ELISA方法檢測IL-1β的濃度。第3小時IL-1β的積累濃度達到峰值，此時IL-1β的濃度為33.484 4 pg/ml，然后迅速降低維持正常量，見圖1。

2.2 ELISA檢測IL-6濃度的時間曲線 LPS作用THP-1細胞后，按照一定的時間收集培養基，使用ELISA方法檢測IL-6的濃度。第16小時IL-6的積累濃度達到峰值，此時IL-6的濃度為33.487 5 pg/ml，然后迅速降低維持正常量，見圖2。

圖1 IL-1β濃度的時間曲線

圖2 IL-6濃度的時間曲線

2.3 ELISA檢測IL-1α濃度的時間曲線 LPS作用THP-1細胞后，按照一定的時間收集培養基，使用ELISA方法檢測IL-1α的濃度。第18小時IL-1α的積累濃度達到峰值，此時IL-1α的濃度為75.780 4 pg/ml，然后迅速降低維持正常量，見圖3。

圖3 IL-1α濃度的時間曲線

2.4 實時定量檢測IL-1β的表達 對最早達到峰值的IL-1β，通過實時定量PCR檢測其在LPS作用下的表達情況。對照組的mRNA水平為(1.211±0.2120)，LPS作用THP-1細胞1 h后表達量達到(3.294±0.7220)，是對照組的2.72倍；2 h后達到(5.631±1.0570)，是對照組的4.65倍，差異有統計學意義，見圖4。這與ELISA檢測的結果相吻合。

圖4 LPS對THP-1細胞IL-1β mRNA表達的影響

3 討論

AS是導致眾多心腦血管疾病的主要原因之一，嚴重危害人類健康，深入研究AS發病的機制意義重大。1999年Ross明確提出“AS是一種炎癥性疾病”，因此感染因素在AS的發生與發展中所扮演的角色得到大量研究者的重視。LPS是革蘭氏陰性菌的內毒素，其作用于參與心血管事件的各類型細胞，比如：內皮細胞、血管平滑肌細胞、單核/巨噬細胞等就成為觀察AS在模擬炎癥狀態的有效的細胞模型。隨著研究的不斷深入，發現了大量參與AS的炎性因子，并且它們在AS的不同發展階段得到表達。這些炎癥因子作為一種介質，作用于參與AS形成的內皮細胞、單核/巨噬細胞、淋巴細胞、平滑肌細胞、血小板等，并通過自分泌以及旁分泌的形式使它們相互聯系，相互影響[3]。因此，探討AS炎癥過程的相關因子，研究這些炎癥因子在整個AS發生、發展過程中的濃度變化，對了解動脈粥樣硬化的進程有一定的意義。本文選擇了IL-1α、IL-1β、IL-6三種白介素作為檢測AS炎癥進程的指標。

IL-6由多種免疫細胞產生，參與細胞的增殖、分化以及機體免疫應答的調節，是機體抗感染免疫反應的重要介質[4]。AS斑塊中發現有IL-6的表達，可能通過促進基質金屬蛋白酶(MMPs)和TNF-α的表達導致斑塊不穩定。研究顯示ACS患者循環血液中的IL-6含量高于穩定性心絞痛患者以及健康對照，不穩定型心絞痛患者如果入院后48 h IL-6水平較入院時升高，則易發生聯合終點事件，包括死亡、心肌梗死或頑固性心絞痛[5]。

IL-1β是一種炎性細胞因子，具有多種致AS發生的生物學效應[6]。它主要由活化的巨噬細胞產生，內皮細胞，平滑肌細胞，成纖維細胞也能產生IL-1。研究表明IL-1β通過促進平滑肌細胞增生、促進白細胞粘附于內皮、調節低密度脂蛋白(LDL)代謝、誘導MMPs合成、增加血管通透性、抑制血管收縮以及增加促凝活性參與血管功能的調節[7]。因此IL-1可能參與了AS的發病以及球囊擴張術后血管內皮的損傷愈合過程。

實驗數據顯示：LPS刺激THP-1細胞，三種白介素累積量達到高峰值時間和濃度各不相同，IL-1β在LPS刺激3 h即達到高峰，說明IL-1β產生時間最早，產生速率快，可能在炎癥反應的早期起作用。IL-1α和IL-6分別于18 h和16 h達到高峰，產生速率較慢，可能在炎癥后期起作用。有資料顯示動脈粥樣硬化過程中IL-1β的產生對IL-6的產生有促進作用：在IL-1β存在的情況下，IL-6各階段累積量多，而在缺乏IL-1β的情況下，IL-6累積量顯著減少。實驗數據顯示IL-1β開始產生與達到峰值都先于IL-6，一定程度上可驗證這一說法。同時有研究表明IL-1β可誘導IL-6合成。

巨噬細胞浸潤，形成泡沫細胞是AS的標志[8]，其產生炎癥因子隨時間的變化在一定程度上反映了動脈粥樣硬化的程度，LPS誘發THP-1細胞的反應表明IL-1α、IL-1β、IL-6可能在不同的時間起主導作用，同時相互之間有一定促進依存關系。借此對疾病的診斷有一定的幫助。

[1]張明嬌,李珉珉.急性冠脈綜合征易損斑塊生物學標志物的研究進展[J].臨床檢驗雜志,2015,33(1):49-51.

[2]Yoshida H,Kisugi R.Mechanisms of LDL oxidation[J].Clin Chim Acta,2010,411(23-24):1875-1882.

[3]莫文魁,陳群清.體外循環對腦血管影響的研究進展[J].廣東醫學,2013,34(15):2422-2424.

[4]張紅超,于魯峰,李玲可,等.白細胞介素-6在全身炎癥反應中對冠脈內皮細胞的作用[J].中華實驗外科雜志,2008,25(10): 1292-1293.

[5]王守力,韓雅玲,劉麗軍,等.不穩定性心絞痛患者血漿白細胞介素-6和高敏C反應蛋白的變化[J].中華老年心腦血管病雜志, 2008,10(6):434-436.

[6]靳夢醒,閆 海,程艷偉,等.辛伐他汀對oxLDL誘導的巨噬細胞活性氧及IL-1β分泌的影響[J].中國藥理學通報,2014,30(5): 692-696.

[7]Ridker PM,Luscher TF.Anti-inflammatory therapies for cardiovascular disease[J].Eur Heart J,2014,35(27):1782-1791.

[8]Libby P,Ridker PM,Hansson GK.Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis[J].Nature,2011,473(7347): 317-325.

Expression of IL-1 and IL-6 of macrophages in the process of atherosclerosis.

LIU Yan-hong.Department of Clinical Laboratory,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo explore the relationships between acute coronary syndrome and inflammatory factors which were produced by macrophages with lipopolysaccharide(LPS).MethodsThe THP-1 cells were culturedin vitroand divided into research group and control group at random.LPS was used in the research group,but not in the control group.The concentration of interleukin-1β(IL-1β),interleukin-1α(IL-1α),interleukin-6(IL-6)were determined by ELISA.The expression of IL-1βwas determined by real time PCR.ResultsThe results of ELISA showed that the concentrations of IL-1β,IL-1α,IL-6 were changing with time courses.The peak value of IL-1βwas observed at 3 h,with that IL-6 observed at 16 h and that of IL-1αobserved at 18 h.The differences between the research group and the control group were statistically significant(P＜0.05).ConclusionThe LPS affects the expression of IL-1β,IL-6,IL-1αof macrophages,with the peak values observed at different time points,which indicates that IL-1β,IL-6 and IL-1αplay the leading role at different times in the process of acute coronary syndrome.

Interleukin-1β(IL-1β);Interleukin-6(IL-6);Interleukin-1α(IL-1α);Lipopolysaccharide (LPS);Atherosclerosis(AS)

R541.4

A

1003—6350（2015）19—2818—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.19.1028

2015-03-25)

國家自然科學基金(編號：81170273)

劉艷紅。E-mail：1376090683@qq.com