乙型肝炎病毒對白細胞介素35表達影響的研究

祝成亮，李 艷，袁 麗，劉興暉

(1.武漢大學人民醫院檢驗科，湖北 武漢 430060；2.上海市浦東新區公利醫院檢驗科，上海 200135)

乙型肝炎病毒對白細胞介素35表達影響的研究

祝成亮1，李 艷1，袁 麗1，劉興暉2

(1.武漢大學人民醫院檢驗科，湖北 武漢 430060；2.上海市浦東新區公利醫院檢驗科，上海 200135)

目的 探討乙型肝炎病毒(HBV)對白細胞介素35(IL-35)表達的影響。方法采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測108例乙型肝炎患者和115例健康對照者IL-35的血清含量，將HBV感染性克隆pHBV1.3轉染THP-1細胞，采用逆轉錄PCR(RT-PCR)及ELISA檢測細胞IL-35 mRNA及蛋白的表達。結果HBV患者IL-35血清水平明顯高于健康對照者，差異有統計學意義(P＜0.05)，THP-1細胞轉染pHBV1.3后IL-35mRNA及蛋白的表達升高。結論HBV能夠上調IL-35的表達。

乙型肝炎病毒；白細胞介素35；酶聯免疫吸附試驗；表達

乙型肝炎病毒(HBV)是導致乙型肝炎和原發性肝細胞癌的病原體。研究表明，HBV感染后引起機體的免疫應答反應，促進很多炎癥因子的過度表達和分泌，導致肝細胞的破壞和肝臟組織的損傷[1]。白細胞介素35(IL-35)屬于IL-12家族的新成員，包括病毒誘導基因3(EBI3)和IL-12 p35兩個亞基，是一種抑制性細胞因子，由調節性T細胞合成和分泌[2]。但目前尚未有HBV與IL-35相關性的研究報道。本研究主要通過體內外實驗探討HBV對IL-35表達的影響，為揭示HBV的致病機理奠定一定的理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集本院臨床確診的乙型肝炎患者108例，其中，男65例，女43例，平均(35.9±15.3)歲。選擇115例健康體檢者作為正常對照組，其中男性62例，女性53例，平均(37.8±16.8)歲。所有患者均無其他嗜肝病毒的感染。

1.2 材料 單核細胞株THP-1由武漢大學典型培養物保藏中心提供RNA提取試劑TRIzolR購自invitrogen公司；IL-35 ELISA檢測試劑盒購自Cusabio Biotech公司；M-MLV逆轉錄酶購自Promega公司；HBV感染性克隆pHBV1.3由本室保存；引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 THP-1細胞的培養 THP-1培養在RPMI1640培養液(含10%的胎牛血清，100 mg/L鏈霉素和100 U/ml青霉素)，在37℃、濃度為5%CO2恒溫箱中進行培養。

1.3.2 THP-1細胞轉染 采用電穿孔進行轉染，待THP-1細胞至對數生長晚期，4℃離心收集細胞，洗滌后加入電穿孔緩沖液重懸，加入質粒DNA混勻，設置電壓為300 V，電流1 000μF進行電穿孔。

1.3.3 RT-PCR檢測 TRIzolR提取THP-1細胞的RNA，M-MLV逆轉錄酶反轉錄成cDNA，用IL-35兩個亞基基因的檢測引物p35：5'-CTCCTTGTGGCTACCCTG-3'(上游引物)，5'-GCAACTCCCATTAGTTATGAA-3'(下游引物)，EBI3：5'-CCGCCTGCTCCAAACTCCAC-3'(上游引物)，5'-CGGGCTTGATGATGTGCTCTGT-3'(下游引物)進行PCR擴增，同時用β-actin的檢測引物進行平行PCR擴增[3]，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.3.4 ELISA檢測 IL-35檢測采用ELISA檢測試劑盒，按照說明書操作進行測定。

1.4 統計學方法 統計學分析采用SPSS13.0軟件，數據以均數±標準差(±s)表示，健康對照和HBV患者IL-35血清含量的比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HBV患者IL-35血清水平升高 筆者采用ELISA分別檢測了HBV患者和健康體檢者的IL-35血清含量。結果顯示，HBV患者血清IL-35水平為(387.3±126.5)pg/ml，健康對照為(158.7±48.4)pg/ml，差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 HBV在細胞水平上調IL-35 mRNA和蛋白的表達 為探討HBV在細胞水平對IL-35表達的影響，筆者將HBV感染性克隆pHBV1.3轉染THP-1細胞，同時設立轉染空載體pBlue-ks作為空白對照。48 h后，筆者檢測了IL-35 mRNA和蛋白的表達情況，結果表明，轉染pHBV1.3后IL-35 mRNA表達上調，同時細胞上清中IL-35的含量較空白對照高[(216.3±25.1)pg/ml vs(136.5±18.7)pg/ml]，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 IL-35兩個亞基p35和EBI3 mRNA的檢測

3 討論

HBV感染是一個全球性問題，大約20億人感染乙肝病毒，其中有3.5億人為慢性感染。HBV感染會導致急性或慢性肝損傷，甚至肝硬化、肝細胞癌[4]，但HBV的致病及致癌機理目前尚不清楚。研究表明，HBV感染機體會引起一些細胞因子表達水平的改變，如IL-6、IL-12在HBV感染后血清水平升高[5]。我們前期的研究工作也發現HBV患者IL-27的表達水平升高，本研究通過體內試驗探討了HBV對IL-35表達的影響。檢測結果顯示，HBV患者IL-35血清含量高于正常對照，表明HBV能夠在體內上調IL-35的表達，進一步通過細胞水平進行了證實，pHBV1.3是HBV的感染性克隆，將pHBV1.3轉染單核細胞株THP-1建立HBV細胞感染的模型[3]，結果表明，轉染pHBV1.3后，IL-35 mRNA和蛋白的含量均升高，證實HBV能夠在體外上調IL-35的表達。

IL-35是IL-12家族的新成員，主要有調節性T細胞(Treg)調節性B細胞(Breg)合成和分泌，具有重要的生物學功能，如刺激Treg細胞增殖、抑制Teff增殖、抑制Th17細胞的分化等，同時在機體抗感染，自身免疫性疾病的發生和發展等方面均發揮著重要作用[5]。

目前認為，HBV致病并非HBV直接損傷肝細胞，而是由于病毒感染人體后所引發的機體免疫應答導致肝臟的病理性損傷所致。HBV感染后引起體內細胞因子如IL-27、IL-35等的過量表達，這些細胞因子參與機體的炎癥反應，過度的炎癥反應引起肝臟不斷地被修復和損傷，逐漸發展為肝纖維化，最終會導致肝癌的發生。

綜上所述，本研究證實了HBV能夠在體內外上調IL-35的表達，但HBV如何調節IL-35的表達，其分子機制如何？IL-35對HBV的復制有無影響，尚待進一步研究。

[1]Busca A,Kumar A.Innate immune responses in hepatitis B virus (HBV)infection[J].Virol J,2014,11:22.

[2]Yang Y,Xuan M,Zhang X,et al.Decreased IL-35 levels in patients with immune thrombocytopenia[J].Hum Immunol,2014,75(8): 909-913.

[3]Zhu CL,Zhang R,Liu L,et al.Hepatitis B virus enhances interleukin-27 expression bothin vivoandin vitro[J].Clin Immunol,2009, 131(1):92-97.

[4]You CR,Lee SW,Jang JW,et al.Update on hepatitis B virus infection[J].World J Gastroenterol,2014,20(37):13293-13305.

[5]Wang S,Chen Z,Hu C,et al.Hepatitis B virus surface antigen selectively inhibits TLR2 ligand-induced IL-12 production in monocytes/ macrophages by interfering with JNK activation[J].J Immunol, 2013,190(10):5142-5151.

Effect of hepatitis B virus on the expression of interleukin 35.

ZHU Cheng-liang1,LI Yan1,YUAN Li1,LIU Xing-hui2.1.Department of Clinical Laboratory,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA; 2.Department of Clinical Laboratory,Shanghai Pudong New District Gongli Hospital,Shanghai 200135,CHINA

ObjectiveTo oexplore the effect of hepatitis B virus(HBV)on the expression of interleukin 35 (IL-35).MethodsSerum levels of IL-35 in 108 patients of HBV and 115 healthy controls were measured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).HBV infectious clone pHBV1.3 was transfected into HepG2 cells. RT-PCR and ELISA were used to measure the expression of mRNA and protein.ResultsSerum level of IL-35 was significantly higher in HBV patients as compared with healthy controls(P＜0.05).Expression of IL-35 mRNA and protein were elevated with pHBV1.3 transfected.ConclusionHBV can upregulate the expression of IL-35.

Hepatitis B virus;Interleukin 35;Enzyme-linked immunosorbent assay;Expression

R512.6+2

A

1003—6350（2015）19—2874—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.19.1045

2015-04-14)

國家自然科學基金(編號：81101485)；國家臨床重點專科專項經費(編號：2010305)；湖北省自然科學基金(編號：ZRY2014000315)

李 艷。E-mail：48329061@qq.com