膠乳增強免疫透射比濁法測定NGAL的性能評價

李 玲，李從榮

(武漢大學人民醫院檢驗科，湖北 武漢 430060)

膠乳增強免疫透射比濁法測定NGAL的性能評價

李 玲，李從榮

(武漢大學人民醫院檢驗科，湖北 武漢 430060)

目的 評價膠乳增強免疫透射比濁法商品化試劑盒測定中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)的性能。方法分析商品化NGAL膠乳增強免疫透射比濁法試劑盒在全自動生化分析儀上檢測的精密度、準確度、線性、抗干擾能力和比對實驗等性能。結果檢測的準確度較好，批內精密度(CV)≤10%，批間精密度(CV)≤15%，NGAL濃度在25～2 565 ng/ml范圍內，理論值與實測值均呈線性相關，相關系數r≥0.990；檢測不同濃度干擾物（甘油三酯、膽紅素、血紅蛋白、抗壞血酸）時，其干擾程度≤10%，NGAL試劑盒的檢測結果均不受影響。兩個不同全自動生化分析儀廠家間比較，相關系數為0.996，線性回歸方程為y=0.994x-5.388，預期偏差可接受。結論該商品化NGAL試劑盒的準確度、精密度、線性范圍和抗干擾能力均良好，可批量測定，且快速、操作方便、簡單，可作為臨床常規NGAL測定方法使用。

膠乳增強免疫透射比濁法；中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白；性能；評價

中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)是載脂蛋白家族成員之一，屬于脂質運載蛋白超家族[1]。NGAL早期檢測主要采用免疫組化SP法和酶聯免疫吸附法，限制了其在臨床的常規應用。本試驗采用國產商品化試劑盒和日本進口全自動生化分析儀，用膠乳增強免疫比濁法定量檢測NGAL，旨在評價NGAL檢測方法的性能，為其臨床應用提供指導。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 東芝全自動生化分析儀、日立全自動生化分析儀、武漢市長立生物技術有限責任公司NGAL試劑、質控品、校準品。

1.2 研究對象 收集本院門診100例患者新鮮血清，男性58例，女性42例，年齡10～65歲。收集的血清標本均無溶血、黃疸和脂血。分裝好后置-20℃冷凍保存，血清標本在復溶后24 h內檢測。

1.3 標本采集 于清晨采集研究對象空腹靜脈血5 ml，15～20 min待血液完全凝固后3 500 r/min離心5 min后分離血清。

1.4 方法

1.4.1 NGAL檢測原理 標本中的NGAL與試劑中的NGAL抗體膠乳顆粒反應，產生凝集以致濁度上升，該濁度高低與NGAL濃度呈正比。通過測定特定波長的吸光度值變化，參照校準曲線即可計算出血清中NGAL的含量。

1.4.2 NGAL濃度的檢測方法 按試劑生產廠家提供的上機參數進行設置并定標，待定標通過后進行實驗。

1.4.3 精密度驗證實驗 參考CLSI文件EP5-A2[2]，實驗標本的準備：收集健康人新鮮混合血清和不同濃度的NGAL血清標本，配制成所需要的濃度：高濃度(1 275 ng/ml，H)、中濃度(733 ng/ml，M)、低濃度(98 ng/ml，L)各30套(每套分裝300 μl)，-20℃冷凍保存。批內精密度測定：取高、中、低值三個不同濃度的血清各一份，分別用試劑盒校準，當天每隔1 h測定一次，重復測定20次，計算平均值(Mean)、標準差(S)和變異系數(CV)。批間精密度測定：用試劑盒單次校準后，每天分別測定一次高、中、低值三個不同濃度的血清，共20 d，計算Mean、S和CV。

1.4.4 準確度驗證實驗 用批號為14-0121P的校準品校準檢測系統后，對同一批號和不同批號(15-0130)校準品進行檢測，各重復測定3次，分別計算平均值、絕對偏差和相對偏差。

1.4.5 線性驗證實驗 參考CLSI文件EP6-A[3]，取高值標本(2 565 ng/ml)和低值標本(25 ng/ml)等量混勻后制備中值標本(1 295 ng/ml)，中值標本再分別與低、高值標本等量混勻，得兩個不同濃度水平的標本(660 ng/ml、1 930 ng/ml)，5個不同濃度水平的標本(25 ng/ml、660 ng/ml、1 295 ng/ml、1 930 ng/ml、2 565 ng/ml)分別重復測定4次后求平均值。參考CLSI文件EP6-A進行線性分析。

1.4.6 干擾驗證實驗 臨床化學實驗室中常見的干擾來自于血清標本，標本的脂血、黃疸、溶血和抗壞血酸是最常見的干擾因素。本實驗選取NGAL為98 ng/ml和1 275 ng/ml的兩個濃度水平標本作為基礎標本。其中將干擾物質與基礎標本按不同比例混合，使其甘油三酯系列干擾濃度為：2 mmol/L、4 mmol/L、6 mmol/L、8 mmol/L、10 mmol/L；膽紅素系列干擾濃度為：100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L、400 μmol/L、500 μmol/L；血紅蛋白系列干擾濃度為：1.0 g/L、2.0 g/L、3.0 g/L、4.0 g/L、5.0 g/L；抗壞血酸系列干擾濃度為：300 μmol/L、600 μmol/L、900 μmol/L、1 200 μmol/L、1 500 μmol/L。將等體積的生理鹽水加入混合血清中，作為無干擾血清，同時測定NGAL濃度各10次，分別取均值，干擾值=各組均值-未加干擾物相應的均值。按CLSI文件EP7-A2[4]進行干擾試驗評價。

1.4.7 比對實驗 參考CLSI文件EP9-A2[5]，每天檢測8份臨床患者新鮮標本并編號，按照1→8和8→1的順序分別在東芝全自動生化分析儀和日立全自動生化分析儀上進行檢測，連續檢測5 d，分別求其均值。組內離群值檢查：以絕對差值均值的4倍作為每個檢測方法的“可接受”限，以相對差值均值的4倍作為標準化檢測界限，如果有一個值超過上述“可接受”限或相對范圍的檢測界限，檢查原因，并從數據組中刪除此值。從數據中刪除的離群值不得超過一個。數據作圖：以日立全自動生化分析儀的結果為X軸，以東芝全自動生化分析儀結果為Y軸作散點圖。計算NGAL在兩個醫學決定水平(Xc=100 ng/ml、200 ng/ml)的預期偏差Bc和預期偏差95%的可信區間，預期偏差Bc公式為Bc=a+(b-1)Xc。以1/2CLIA’88允許誤差作為臨床可接受標準，計算醫學決定水平(Xc)的允許誤差，評判偏差是否可接受。

1.5 統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行分析。線性范圍實驗的相關性采用曲線擬合(Curve estimation)，回歸方程用線性回歸分析。

2 結果

2.1 精密度實驗 不同濃度水平血清的CV在0.82%～3.54%，CV在2.34%～4.27%，與廠家聲明的批內精密度和批間精密度一致，見表1和表2。

表1 NGAL批內精密度實驗結果

表2 NGAL批間精密度實驗結果

2.2 準確度實驗 兩個不同批號校準品的測定均值和靶值的相對偏差在2.16%～4.33%，與廠家聲明的準確度一致，見表3。

2.3 線性實驗 NGAL線性回歸方程為y= 0.991x-10.49，r=0.999 2，NGAL在25～2 565 ng/ml范圍內呈良好線性，偏倚較小，能滿足臨床需要。

2.4 干擾實驗 甘油三酯≤10 mmol/L，血紅蛋白≤5.0 g/L，抗壞血酸≤1 500 μmol/L，膽紅素≤500 μmol/L時，試劑盒測定NGAL的結果未受到干擾。

2.5 比對實驗 兩個系統內和系統間均無離群點；繪制日立生化分析儀和東芝生化分析儀兩個系統測定NGAL的散點圖(見圖1)。兩個系統的相關性較好，相關系數r2為0.996，線性回歸方程為Y= 0.994x-5.388。偏差：醫學決定水平(100 ng/ml、200 ng/ml)的預期偏差分別為4.8和4.2，預期偏差的95%可信區間分別為94.3～105.7和191.3～207.1，允許誤差為10%。允許誤差大于預期偏差的95%可信區間的上限，偏差可以接受。

表3 NGAL準確度實驗結果

圖1 東芝生化分析儀均值對日立生化分析儀均值的散點圖

3 討論

目前，我們已知的NGAL功能可能與免疫炎癥反應[6-7]、腫瘤發生發展[8-10]以及腎臟發育有關[11]。大量研究證實NGAL是早期檢測急、慢性腎功能損傷的重要指標[12-15]，也是診斷急性腎損傷的最有效生物學標志之一[16]。有學者發現NGAL和中性粒細胞相關載脂蛋白膜受體(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin receptor，NGALR)的表達與結直腸癌的發生、浸潤和轉移相關，可輔助臨床診斷，并有可能成為結直腸癌臨床治療的新靶點[17]。另外研究發現妊娠期高血壓患者血液中NGAL的含量較正常孕婦也出現顯著升高[18]。NGAL新的臨床意義正在不斷被發現，因此，NGAL的檢測方法及其性能指標十分重要。

精密度和準確度是反映檢測系統的重要性能指標，其中良好的精密度是進行其他性能指標實驗的前提。根據CLSI文件EP5-A2評價方案的實驗結果確認，NGAL的批內精密度和批間精密度均可接受；在此基礎上進行準確度實驗，采用兩個不同批號NGAL校準品評價檢測系統的準確度，兩個不同批號校準品的驗證值與靶值的相對偏差在2.16%～4.33%，可接受。線性驗證顯示NGAL在25～2 565 ng/ml范圍內呈良好線性；血清標本中甘油三酯濃度≤10 mmol/L、膽紅素濃度≤500 μmol/L、血紅蛋白濃度≤5.0 g/L、抗壞血酸濃度≤1 500 μmol/L時，NGAL結果未受到干擾；東芝全自動生化分析儀與日立全自動生化分析儀檢測同一商品化NGAL試劑相關性較好，相關系數r2=0.996。

綜上所述，膠乳增強免疫透射比濁法試劑盒測定NGAL的性能較好，在全自動生化分析儀上可批量檢測、速度快、樣品用量少、操作方便、簡單，可作為臨床常規的NGAL檢測方法使用。

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Evaluation of the performance of latex-enhanced immunoturbidimetric assay for neutrophil gelatinase-associated lipocalin.

LI Ling,LI Cong-rong.Department of Clinical Laboratory,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo evaluate the performance of latex-enhanced immunoturbidimetric assay in the determination of neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL).MethodsThe precision,accuracy,linearity and anti-jamming performances were evaluated during the tests on a fully automatic biochemical analyzer with the commercialized kit of latex-enhanced immunoturbidimetric assay for NGAL.ResultsA good accuracy was obtained, with the intra specific variation coefficient(CV)of≤10%and the inter specific variation coefficient(CV)of≤15%. The measured values were linearly related to the theoretical values when the concentrations of NGAL were in the range of 25～2 565 ng/ml(r≥0.990).It was observed that the interfering components had no impact on the test results from NGAL kits when different concentrations of the interfering components(such as triglycerides,bilirubin,hemoglobin,ascorbic acid)were presented in the test,with the degree of interference≤10%.Comparison between two different automatic biochemical analyzer manufacturer showedr2=0.996,y=0.994x-5.388.The bias was acceptable between the two systems.ConclusionThe accuracy,precision,linearity and anti-interference ability of commercialized kit for NGAL evaluation are excellent.The kit is suitable for a great quantity samples analyzing,and the assay is fast,simple,and can be easily operated,which can be used as a routine clinical method for NGAL determination.

Latex-enhanced immunoturbidimetric assay;Neutrophil gelatinase-associated lipocalin;Performance;Evaluation

R446.61

A

1003—6350（2015）19—2882—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.19.1048

2015-03-16)

李從榮。E-mail：115099473@qq.com