高壓抗原修復液的pH值對淋巴組織免疫組化染色的影響

陳 薇，郭愛桃，李亞卓，孫 璐

(中國人民解放軍總醫院海南分院病理科，海南 三亞 572013)

高壓抗原修復液的pH值對淋巴組織免疫組化染色的影響

陳 薇，郭愛桃，李亞卓，孫 璐

(中國人民解放軍總醫院海南分院病理科，海南 三亞 572013)

目的 研究高壓抗原修復液的pH值對淋巴組織免疫組化染色的影響。方法運用高壓的抗原修復方式，按修復液pH值的不同分為pH 6.0枸櫞酸抗原修復組和pH8.0EDTA抗原修復組，對76例淋巴組織進行免疫組化染色，每例分別標記抗體CD3、CD20和CD5。結果pH 6.0枸櫞酸抗原修復組有9例陽性標記不明確，其中5例出現了細胞膜破損，67例符合診斷標準；pH8.0EDTA抗原修復組有60例陽性標記不明確，其中59例出現了細胞膜破損，僅有16例組織染色符合診斷標準，兩組間比較差異有統計學意義(P＜0.05)。結論免疫組化染色中，使用pH 8.0 EDTA抗原修復液對淋巴組織進行高壓修復，致使淋巴細胞胞膜破損，使用pH 6.0枸櫞酸高壓修復有助于避免這一現象。

淋巴組織；免疫組化染色；抗原修復液；EDTA；枸櫞酸

免疫組織化學(Immunohistochemistry，IHC；以下簡稱免疫組化)染色技術是在組織化學方法上結合免疫學的理論發展起來的一門技術，近年來隨著染色技術的不斷改進和提高，免疫組化已經被越來越廣泛地應用于病理常規工作中，成為病理診斷不可或缺的檢測技術和手段，為輔助疾病診斷、判斷預后，以及檢測腫瘤組織的相關抗原，指導臨床治療提供了重要依據[1]。但是免疫組化染色是一種多步驟、多因素決定的實驗方法，存在很多干擾因素，標本的固定、脫水、實驗室操作條件以及操作人員素質等的不同都可導致結果的差異，甚至有時會因為不同地區的溫度、濕度以及水質的差異而影響染色結果，出現不理想的染色，從而影響醫生的病理診斷，嚴重者可能會造成誤判和誤診。在眾多影響因素中，抗原修復方式是影響免疫組化染色結果的最主要因素之一[2]。中國人民解放軍總醫院海南分院(以下簡稱海南分院)開診近兩年來，在免疫組化染色中出現了一些異常現象，其中比較集中的問題體現在淋巴細胞出現難以解釋的胞漿腫脹和胞膜彌散現象，從而導致陽性標記不明確，染色效果不理想，給病理醫生判斷免疫組化結果帶來了很大困難，經調整高壓修復時間和3%H2O2的孵育時間，效果均不明顯。本文針對這一問題通過調整高壓修復液的pH值進行對比研究，探討高壓修復液的pH值與免疫組化染色切片中淋巴細胞胞漿腫脹和細胞膜彌散現象之間的關系，為以后的免疫組化染色工作以及病理醫生對于免疫組化切片的觀察和結果判讀提供可靠的理論指導依據。

1 材料與方法

1.1 一般資料 復查中國人民解放軍總醫院海南分院病理科2012年7月至2014年7月期間所有曾進行免疫組化染色的病例，選擇其中富于淋巴細胞且為非穿刺活檢組織者作為研究對象，共76例。

1.2 試驗設計及分組 采用配對實驗，分為EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)(pH 8.0)緩沖液抗原修復組和枸櫞酸(pH 6.0)緩沖液液抗原修復組兩組。

1.3抗體及試劑 標記抗體有CD3、CD5和CD20，所用一抗均使用安必平公司即用型工作液，二抗使用安必平LBP-VBrightI通用型二抗聚合物檢測試劑盒。

1.4 方法 挑選的組織塊均行3 μm連續切片，每例6張，EDTA(pH 8.0)緩沖液抗原修復組和枸櫞酸(pH 6.0)緩沖液抗原修復組各3張，分別在切片上進行修復液和標記抗體的標識。所有切片均統一進行70℃烤片機烤片1 h，常規脫蠟及水化。水化后EDTA(pH 8.0)抗原修復組切片放入EDTA(pH 8.0)抗原修復液高壓修復1.5 min；枸櫞酸(pH 6.0)抗原修復組切片放入枸櫞酸(pH 6.0)抗原修復液中高壓修復2.5 min。兩組切片均同時進行免疫組化標記，DAB顯色，蘇木素返藍，以細胞膜的棕黃色著色為陽性反應。

1.5 統計學方法 應用SPSS16.0統計軟件進行統計分析，采用χ2檢驗對兩組的免疫組化染色結果進行統計學處理，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

76例經EDTA(pH 8.0)抗原修復液進行高壓修復的切片中有60例染色效果欠佳，陽性標記不明確，影響了醫生對結果的判讀，其中59例均出現了細胞漿腫脹和細胞膜彌散現象，僅有16例組織符合診斷標準；而枸櫞酸(pH 6.0)抗原修復液修復組中有9例陽性標記不明確，其中5例出現了細胞漿腫脹和細胞膜彌散現象(圖1~圖6)，67例符合診斷標準。統計學分析發現無論在陽性標記明確與否的比例上，還是細胞漿腫脹和細胞膜彌散現象的發生率上，兩組間差異均具有統計學意義，見表1。

表1兩種pH值的抗原修復液修復后的免疫組化染色切片比較[例(%)]

圖1 CD3抗體標記，枸櫞酸(pH 6.0)高壓修復，細胞膜陽性；圖2 CD3抗體標記，EDTA(pH 8.0)高壓修復，細胞膜陽性彌散；圖3 CD5抗體標記，枸櫞酸(pH 6.0)高壓修復，細胞膜陽性；圖4 CD5抗體標記，EDTA(pH 8.0)高壓修復，細胞膜陽性彌散；圖5 CD20抗體標記，枸櫞酸(pH 6.0)高壓修復，細胞膜陽性；圖6 CD20抗體標記，EDTA(pH 8.0)高壓修復，細胞膜陽性彌散。

3 討 論

在臨床病理診斷中，免疫組化染色已經成為一種不可或缺的檢測手段，尤其對腫瘤組織的起源、分類和鑒別都發揮了重要的作用。免疫組化染色切片的質量直接影響著病理醫生對于染色結果的判讀，因此良好的免疫組化染色是正確判斷染色結果的基礎和前提。然而免疫組化染色過程中的每一個操作環節都有可能對染色結果產生影響，如：組織取材、固定、切片；抗原修復方式、修復溫度、修復時間以及修復液的pH值；還包括各種液體的配制、DAB顯色等等；有時甚至會因為不同地區的溫度、濕度以及水質不同而產生染色差異，因此摸索出適合自己實驗室的最佳實驗條件，對于穩定免疫組化染色的質量至關重要。

組織標本因為在使用福爾馬林固定后蛋白質分子發生交聯，造成抗原被遮蔽，因此需要通過抗原修復打開醛基，使抗原決定簇暴露，從而使特異性抗體與之結合[3]。在多種影響免疫組化染色結果的因素中抗原修復被認為是最重要的影響因素之一。不同的抗原修復對于裂解醛-氨基之間交聯或蛋白質之間的交聯的能力不同，從而使抗原決定簇暴露的程度不同；此外不同抗原對于不同抗原修復方式的敏感性不同，也造成了標記效果不同；甚至相同的抗體不同克隆號在不同的抗原修復方式下與抗原的結合能力也有所不同。因此，一種抗原修復方法不可能同時適用于所有抗原的修復,選用最佳的抗原修復方法尤為重要。最佳的抗原修復方式應在暴露抗原決定簇的效果達到最好的情況下，同時還不會對原有的細胞形態造成影響，在對原有的細胞形態造成影響的情況下，即使是被公認為最好的抗原修復方式在實際工作中應用價值也不大。

目前使用較多的抗原修復液有EDTA修復液和枸櫞酸修復液。枸櫞酸修復液pH值為6.0，適合于中性福爾馬林固定、石蠟包埋組織切片的抗原修復，在高壓條件下，其修復效果優于微波修復法和直接煮沸修復法，結果較為穩定，但與EDTA(pH 8.0)抗原修復液相比，對于某些抗體其修復效果相對較弱。早在1995年Shi等[4]就報道了不同pH值抗原修復對免疫組化的影響，并且認為高pH值的高溫抗原修復對于大多數的核抗體和胞漿抗體都能取得不錯的效果，因此，高pH值高壓修復方式，以其時間短、抗原修復效果好和結果穩定等優點，目前被廣泛應用于大多數抗原的修復當中。但有文獻報道EDTA對組織形態及完整性有一定的破壞作用，加之高壓的修復方式，組織形態破壞較為明顯[5-6]，一直未引起同行的重視。

在海南分院病理科免疫組化實驗室條件下，參照所購抗體說明并進行對比實驗后，發現大多數抗原使用EDTA(pH 8.0)高壓熱修復后，可以取得良好的染色效果。但對于富于淋巴細胞的組織，使用EDTA (pH 8.0)抗原修復液進行高壓熱修復后出現了細胞膜破損情況，主要表現為細胞漿腫脹和細胞膜彌散，細胞界限模糊不清，使陽性標記效果不明確，結果判斷困難。經反復多次并多梯隊調整高壓修復時間和3% H2O2的孵育時間后效果均不明顯。本實驗采用配對實驗，在其他試驗條件均相同的情況下對EDTA(pH 8.0)緩沖液和枸櫞酸(pH 6.0)緩沖液兩種不同pH值的抗原修復液進行高壓修復后染色效果的比較，結果發現兩組間無論在陽性標記明確與否的比例上，還是細胞漿腫脹和細胞膜彌散現象的發生率上，差異均具有統計學意義(均P=0.000)，采用枸櫞酸(pH 6.0)抗原修復液進行高壓修復后染色，此種現象基本消失，因此我們認為EDTA對于淋巴細胞的形態具有一定程度的破壞性，導致細胞漿腫脹、細胞膜彌散，影響了抗原抗體的結合反應，同時影響了病理醫生對于免疫組化切片中組織形態的觀察。

有文獻指出在EDTA修復液中加入EDTA-2Na可降低EDTA的電離度,達到減輕對組織破壞的作用[5]，但操作較為繁瑣；另有文獻建議使用高pH值水煮的修復方式代替高壓修復，但此法相對耗時較長，常規工作中的應用受到了一定程度的限制。因此，在科室工作量、工作模式和免疫組化實驗室不變的條件下，對富于淋巴細胞的組織進行免疫組化染色時，為保護細胞形態的完整性，避免影響染色效果，除了對修復條件有特殊要求的抗體外，在采用高溫高壓抗原修復方式時，建議使用枸櫞酸(pH 6.0)修復液來替代EDTA(pH 8.0)修復液[7]。

[1]周小鴿.免疫組織化學染色的干擾因素及其處理[J].臨床與實驗病理學雜志,2006,22(4)：389-392.

[2]駱新蘭,林興滔,羅東蘭,等.pH 9.0不同成分的抗原修復液對免疫組織化學染色結果的影響[J].中華病理學雜志,2012,41(3)：192-194.

[3]郭 麗,祁 榮,吳 鵬.不同的抗原修復方法在免疫組化染色中的應用[J].沈陽醫學院學報,2012,14(3)：152-153.

[4]Shi SR,Imam SA,Young L,et al.Antigen retrieval immunohistochem istry under the influence of pH using monoclonal antibodies [J].J Histochem Cytochem,1995,43(2)：193-201.

[5]成 娘,劉衛平,李甘地.用EDTA緩沖液做抗原修復增進ER、PR免疫組化染色[J].臨床與實驗病理學雜志,2001,17(3)：274.

[6]范 慧,張 緊,杜德利,等.抗原修復液pH對免疫組化的影響[J].山東醫藥,2001,12：72-73.

[7]丁 偉,王德田.簡明病理學技術[M].杭州：浙江科學技術出版社,2014,1：143-149.

Effects of different pH values of high-pressure antigen retrieval buffers on immunohistochemical staining of lymphoid tissue.

CHEN Wei,GUO Ai-tao,LI Ya-zhuo,SUN Lu.Department of Pathology,Hainan Branch of Chinese PLA General Hospital,Sanya 572013,Hainan,CHINA

ObjectiveTo evaluate the influence of pH values of high-pressure antigen retrieval buffers on immunohistochemical staining of lymphoid tissue.MethodsSeventy-six cases of lymphoid tissue were divided into two groups,which were treated with pH 6.0 citrate buffer(pH 6.0 citrate buffer group)and pH 8.0 EDTA buffer(pH 8.0 EDTA group)by high-pressure repairing.Each cases was stained by antibody CD3,CD5,CD20.ResultsIn the pH 6.0 citrate buffer group,9 cases showed unclear positive markers(including 5 cases of lymphotye injury),and 67 cases reached the diagnostic criteria.Of the pH 8.0 EDTA group,60 cases showed unclear positive marker(including 59 cases of lymphocyte injury),and 16 cases reached the diagnostic criteria.The difference between the two groups was statistically significant(P＜0.05).ConclusionUsing pH 8.0 EDTA buffer for high-pressure repairing in immunohistochemical staining often leads to lymphoctye injury,but pH 6.0 citrate buffer could avoid this problem.

Lymphoid tissue;Immunohistochemical staining;Antigen retrieval buffer;EDTA;Citrate

R446.6

A

1003—6350（2015）09—1370—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.09.0492

2014-11-24)

陳 薇。E-mail：chenweiw12@126.com