miR-486-5p在氧化應激引起人骨髓間充質干細胞凋亡中的作用*

胡 明， 黎 佼， 劉寧寧， 黃楨鈞， 伍崇海， 鐘 赟， 劉世明

(廣州醫科大學附屬第二醫院，廣州心血管疾病研究所，廣東 廣州 510260)

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miR-486-5p在氧化應激引起人骨髓間充質干細胞凋亡中的作用*

胡 明▲， 黎 佼▲， 劉寧寧， 黃楨鈞， 伍崇海， 鐘 赟， 劉世明△

(廣州醫科大學附屬第二醫院，廣州心血管疾病研究所，廣東 廣州 510260)

目的： 觀察microRNA-486-5p(miR-486-5p)在氧化應激引起人骨髓間充質干細胞(hMSCs)凋亡中的作用并探討其作用機制。方法: hMSCs經培養鑒定后分為5組：空白對照組、H2O2組、miR-486-5p模擬物+H2O2組、抑制物(αnti-miR)+H2O2組及相應的陰性對照(scrambled control)+H2O2組。熒光定量PCR(real-time PCR)檢測氧化應激誘導hMSCs凋亡過程中miR-486-5p的表達變化。用脂質體分別轉染miR-486-5p的模擬物、抑制物及陰性對照到hMSCs。應用MTT、Hoechst標記和流式細胞術的方法檢測miR-486-5p對氧化應激介導細胞活性下降及凋亡效應的影響，Western blotting檢測凋亡相關蛋白、Akt與其磷酸化水平，采用試劑盒測定caspase-3活性。結果: H2O2誘導hMSCs凋亡過程中miR-486-5p的表達較對照組顯著下降(P<0.05)。與陰性對照組相比，在hMSCs中過表達miR-486-5p，能使細胞在氧化應激情況下活性顯著下降，凋亡發生率增高，蛋白Bcl-2/Bax比值、caspase-3酶原含量及Akt磷酸化水平降低，caspase-3活性增強；而使用抑制物阻遏miR-486-5p的作用后，細胞在氧化應激條件下活性增加，凋亡發生率降低，蛋白Bcl-2/Bax比值及Akt磷酸化水平升高，caspase-3活性下降。結論: 過表達miR-486-5p促進氧化應激引起的hMSCs凋亡，阻遏miR-486-5p的作用抑制氧化應激條件下的hMSCs凋亡，其中作用機制可能與調控Akt通路有關。

MicroRNA-486-5p； 間充質干細胞； 氧化應激； 細胞凋亡

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)作為成體干細胞的一種,由于來源方便，沒有免疫排斥反應，無致瘤性，是較為理想且具有臨床運用前景的一類干細胞。移植BMSCs治療心梗的動物實驗和臨床前期試驗取得了令人鼓舞的成果，但臨床試驗效果差異較大，而且獲益主要來自于早期的心功能改善，對遠期全因死亡等終點事件無明顯改善，這其中心梗后局部惡劣的微環境限制了移植細胞的存活是主要原因之一。心梗發生后，心肌缺血缺氧的同時會誘導活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)生成增多，啟動氧化應激反應(oxidative stress，OS)。移植到心梗周邊區的BMSCs會因缺血缺氧而誘發凋亡，同時也會在氧化應激作用下發生損傷。因此，如果能夠采取方法減少梗死后微環境誘發的移植細胞凋亡，將對提高干細胞移植療效有重大意義。微小RNA(microRNA，miRNA)作為細胞內一類重要的調控分子，調控著細胞分化、增殖、代謝及凋亡等一系列生物學過程[1]。過表達miR-486-5p促進人脂肪間充質干細胞(human adipose tissue-derived MSCs，hAT-MSCs)復制性衰老[2]，低劑量的H2O2也可誘導MSCs提早發生衰老，而大劑量H2O2誘發凋亡[3]，那么我們推測miR-486-5p可能在H2O2誘導的MSCs凋亡中起作用。本研究擬通過H2O2刺激細胞模擬心梗后局部微環境中氧化應激誘導移植的人骨髓間充質干細胞(human mesenchymal stem cells，hMSCs)凋亡，觀察miR-486-5p在氧化應激引起hMSCs凋亡中的作用并探討其可能的作用機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 人骨髓的提取 通過廣州醫科大學附屬第二醫院倫理委員會審查，并與患者簽訂知情同意書后，在廣州醫科大學附屬第二醫院心外科瓣膜病患者開胸手術過程中吸取人骨髓5mL。供體排除腫瘤、肝炎、結核、HIV感染等因素。

1.2 主要試劑及儀器 胎牛血清、Opti-MEM和IMDM培養基(Gibco)；3% H2O2(Sigma)；Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑(Invitrogen)；SYBR Green 熒光定量試劑盒和RNA逆轉錄試劑盒(Toyobo)；Annexin V-FITC Apoptosis detection kit(eBioscience)；caspase-3活性檢測試劑盒(Beyotime)；兔抗Akt、p-Akt和caspase-3抗體(Cell signalling)；Bax、Bcl-2及GAPDH抗體(Santa Cruz)；淋巴細胞分離液(Ficoll)；熒光定量PCR儀(ABI7300)；多功能酶標儀(Tecan)等。

2 方法

2.1 hMSCs的分離、培養、鑒定及H2O2預處理 hMSCs的分離、培養及鑒定參照文獻報道[4-5]。在淋巴細胞分離液上疊加入人骨髓液，以2 000 r/min在4 ℃下離心20min，吸取分離液和血漿界面云霧狀的單個核細胞，用IMDM懸浮并以1 000 r/min離心。后按2×109/m2密度接種于培養瓶中培養，48h后換液，將不貼壁的細胞除去。貼壁細胞每3d換液，待細胞融合度達80%～90%時，胰酶消化傳代。流式細胞術檢測細胞表面CD29、CD31、CD34、CD44、CD45和CD166的表達。選擇P3/P4代細胞，首先細胞轉染24h，然后用H2O2預處理誘導凋亡，參見文獻報道[6]，細胞在無血清IMDM培養8 h，然后加入10 mmol/L H2O2處理8 h以誘導凋亡，后按實驗需要處理細胞。

2.2 Real-time PCR檢測H2O2誘導hMSCs凋亡過程中miR-486-5p的表達變化 按Trizol試劑盒說明書的操作步驟提取貼壁培養的hMSCs的總RNA；按逆轉錄反應試劑盒說明書操作進行逆轉錄反應(37 ℃ 15min，98 ℃ 5min)，反應產物進行PCR擴增；PCR過程按試劑盒說明書操作在ABI7300熒光定量PCR儀上進行。PCR反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個PCR循環。miRNA使用U6作為內參照進行PCR，獲得Ct值后，目的基因的相對定量按2-ΔΔCt計算。

2.3 細胞轉染 按Lipofectamine RNAiMAX說明書操作，hMSCs密度達70%～80%時分別轉染miR-486-5p模擬物、抑制物(anti-miR)及其相應的陰性對照miR-CTL、anti-CTL，轉染終濃度為30 nmol/L，細胞轉染24h后進行H2O2預處理。轉染一般步驟參見轉染說明書。相關miRNA序列見表1。

表1 DNA和RNA寡核苷酸序列

F: forward; R reverse.

2.4 MTT檢測細胞活力 取對數生長期細胞，以100 μL每孔(約6×103個細胞)接種于96孔板。按實驗要求給予不同處理，每組設5個平行孔。處理完畢后，每孔加入50 μL MTT，孵育4 h后吸出上清液，每孔加入150 μL DMSO，水平搖床搖勻，待藍紫色結晶完全溶解后，酶標儀在550 nm波長處檢測每孔的吸光度(A)。細胞存活率(%)=實驗組A/對照組A×100%。

2.5 Hoechst 33342染色觀測凋亡細胞 將hMSCs接種在24孔板上，各實驗組按要求給予不同處理，PBS洗1～2次后加入4%多聚甲醛于4 ℃固定細胞30 min，后PBS洗滌1次，再加10 mg/L Hoechst 33342于37 ℃染色15 min后立即熒光檢測。正常細胞核出現均勻強度的熒光；如出現染色質固縮和(或)核碎裂則為凋亡的細胞。

2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 各實驗組按實驗要求給予不同處理后，按Annexin V-FITC凋亡測定試劑盒(eBioscience)中的操作步驟，每實驗組收集2×105個細胞，PBS洗滌1次，離心后重懸于200 μL緩沖液，加入5 μL Annexin V-FITC混合，室溫下避光孵育10 min。而后加入10 μL PI并立即通過流式細胞儀檢測，Annexin V+/PI-視為早期凋亡細胞，Annexin V+/PI+和Annexin V-/PI+為晚期凋亡和死亡細胞，Annexin V-/PI-則為活細胞。

2.7 Western blotting檢測Akt、p-Akt、caspase-3、Bax和Bcl-2的蛋白水平 每組收集約4×105個細胞，蛋白裂解液進行蛋白提取，BCA法測定蛋白濃度。各組等量蛋白用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉膜，轉過蛋白的硝酸纖維素膜于室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h，而后與相應Ⅰ抗于4 ℃下孵育過夜 [多克隆兔抗磷酸化Akt(1∶500)、Akt(1∶1 000)、caspase-3(1∶1 000)或兔抗Bax(1∶500)，鼠抗Bcl-2(1∶100)]。TBST洗膜后連接辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗(1∶5 000)作為探針。目的蛋白特異條帶化學發光法顯影，經GAPDH(1∶5 000)信號標準化，并通過Image-Pro Plus軟件半定量分析，磷酸化與非磷酸化蛋白的比值代表蛋白磷酸化水平。

2.8 Caspase-3的活性測定 每組收集約4×105細胞，PBS洗滌1次后，加入25 μL裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min后4 ℃ 16 000×g離心10min,提取上清后立即按caspase-3活性檢測試劑盒說明測定活性。

3 統計學處理

數據用均數±標準差(mean±SD)表示，應用SPSS 13.0統計軟件分析，兩組間的差異顯著性采用獨立樣本t檢驗，多組間的差異顯著性采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 hMSCs氧化應激誘導凋亡中miR-486-5p的表達變化

如圖1A所示，采用H2O2誘導hMSCs凋亡后，用real-time PCR方法檢測miR-486-5p的表達變化，結果顯示，H2O2組miR-486-5p的表達水平較control組明顯下調(P<0.05)。

2 miR-486-5p對H2O2引起hMSCs活性下降的影響

如圖1B所示，H2O2刺激后，與陰性對照組相比，轉染miR-486-5p模擬物的hMSCs的細胞活性顯著下降；而抑制miR-486-5p的表達則能使hMSCs的細胞活性增高，差異有統計學意義(P<0.05)。

Figure 1.The changes of miR-486-5p expression in oxidative stress-related apoptosis of hMSCs (A) and the effect of miR-486-5p on H2O2-induced decrease in cell viability (B). SC:scrambled control.Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control; #P<0.05 vs SC+H2O2.

3 miR-486-5p在氧化應激誘導hMSCs凋亡中的作用

如圖2所示，Hoechst熒光染色后，在熒光顯微鏡下觀察到control組細胞核出現均勻的低強度熒光；而在各H2O2處理組中均出現胞核濃縮致密、呈顆粒狀高強度的熒光。轉染miR-486-5p組與陰性對照組相比，濃縮致密、顆粒狀高強度熒光明顯增多；而miR-486-5p抑制物組相比對照組，濃縮致密的高強度熒光減少。Annexin/PI雙染色法流式檢測顯示，H2O2處理后，早凋和晚凋細胞比例相對control組均顯著增加(P<0.05)。氧化應激處理后，轉染miR-486-5p模擬物的hMSCs與陰性對照組的早期凋亡率分別為7.80%±1.68%和6.09%±0.76%，而晚期凋亡率分別為19.72%±3.86%和15.48%±2.63%，這說明過表達miR-486-5p促進H2O2誘導的hMSCs凋亡；而抑制miR-486-5p的表達則拮抗H2O2誘導的hMSCs凋亡(P<0.05)。

Figure 2.The role of miR-486-5p in H2O2-induced hMSC apoptosis. A: apoptosis of hMSCs analyzed by Hoechst 33342 staining. Brightly stained nucleus of hMSCs represents the cells undergoing apoptosis (×20). B: apoptosis was also analyzed by flow cytometry after staining with Annexin V and propidium iodide (PI). C: the quantitative analysis of apoptosis. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control; #P<0.05 vs SC (scambled control)+H2O2.

4 miR-486-5p對氧化應激介導hMSCs凋亡相關蛋白表達、Akt磷酸化水平及caspase-3活性的影響

Akt磷酸化水平在經過H2O2處理后明顯下降(P<0.05)。與陰性對照組相比，在hMSCs中過表達miR-486-5p，能使細胞在氧化應激情況下，Bcl-2/Bax比值、caspase-3酶原含量及Akt磷酸化水平下降(P<0.05)；而使用抑制物阻遏miR-486-5p的作用后，Bcl-2/Bax比值、caspase-3酶原含量和Akt磷酸化水平升高(P<0.05)。H2O2刺激后，過表達miR-486-5p造成caspase-3活性增加，而轉染miR-486-5p抑制物組與陰性對照組相比，caspase-3活性顯著下降(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The levels of apoptosis-related proteins and phosporylation of Akt determined by Western blotting, and the caspase-3 activity detected by a kit in transfected hMSCs after treated with H2O2. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs anti-control+H2O2; #P<0.05 vs miR-control+H2O2; △P<0.05 vs control; ▲P<0.05 vs SC+H2O2.

討 論

心梗發生后，心肌缺血缺氧和再灌注損傷過程中，ROS生成增多，清除減少，啟動氧化應激反應，不僅導致局部組織細胞的損傷，也阻礙移植到心梗周邊區BMSCs的遷徙、分化，甚至直接導致移植細胞凋亡或壞死，從而從根本上限制其移植療效。目前單純BMSCs移植治療心梗遠期獲益不明顯，而進行缺氧、細胞因子、小分子藥物或基因調控等預處理后移植治療能提高植入心臟后BMSCs的存活能力，并產生更好的移植效果。miRNA作為轉錄后調控小分子，能夠與靶基因mRNA的3’-UTR結合，降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。基于其特殊的調控方式，miRNA作為表觀遺傳修飾的靶點有其特有優勢[7]。近年來，miRNA作為細胞內一類重要的調控分子，已被發現在細胞的凋亡信號轉導中發揮了關鍵作用[8]。目前已有多個研究證實miR-486在調控癌細胞生長、侵襲及凋亡中發揮作用并能夠充當一些癌癥的生物學標記[9-10]。而關于miR-486在hMSCs凋亡中的作用迄今尚未見文獻報道。

在哺乳動物細胞凋亡過程中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspases)家族的激活起關鍵作用，正常細胞的caspases處于非活化的酶原狀態，凋亡程序一旦啟動，caspases被激活并隨后發生凋亡蛋白酶級聯反應，從而導致細胞DNA損傷和細胞凋亡。不同的啟動性caspase介導不同的凋亡信號，如caspase-8介導死亡受體相關信號，而caspase-9介導線粒體途徑的死亡信號。雖然在不同細胞或同一細胞受不同刺激誘發凋亡過程中，caspases的激活不盡相同，但普遍認為激活caspase-3是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的必經之路。關于miR-486在氧化應激引起hMSCs凋亡中的作用，本研究通過采用Hoechst染色，流式細胞術，caspase-3活性測定，凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax及caspase-3酶原測定等方法，證實miR-486-5p調節氧化應激引起的hMSCs凋亡。流式細胞術結果顯示，相比control組，H2O2誘導的hMSCs早期凋亡變化不是很明顯，而加大H2O2濃度刺激后，死細胞又大量出現(數據未顯示)。這與文獻報道相一致，可能與MSCs更能耐受H2O2氧化應激刺激有關[11]。

PI3K/Akt通路是蛋白激酶瀑布中的核心成分，參與調控細胞生長、代謝及凋亡等多種病理生理過程[12]。Akt修飾的骨髓間充質干細胞(BMSCs)拮抗凋亡能力增加，移植入心梗后能增強修復梗死心肌的能力[13]。生物信息學軟件預測PI3K/Akt通路中的多種成分都是miR-486的作用靶點，且部分已得到證實[10, 14]。有證據表明PI3K/Akt通路在H2O2誘導MSCs凋亡中起重要作用[15-16]，H2O2誘導凋亡并同時伴Akt活性的下降。本研究通過Western blotting技術檢測Akt蛋白與其磷酸化水平，發現Akt磷酸化水平在經過氧化應激處理后明顯下降，而阻遏miR-486-5p的作用能抑制氧化應激引起的hMSCs凋亡，并且同時伴隨Akt活性明顯升高，因此推測其作用可能是通過增強Akt通路活性來實現的。至于miR-486-5p在氧化應激介導hMSCs凋亡中的作用靶點及具體調控機制有待進一步研究。

綜上所述，H2O2誘導hMSCs凋亡過程中miR-486-5p的表達發生下降；過表達miR-486-5p促進氧化應激引起的hMSCs凋亡，而阻遏miR-486-5p的作用抑制氧化應激條件下的hMSCs凋亡，而且其中作用機制可能與參與調控Akt通路有關。研究結果為尋找提高移植干細胞存活能力提供了新的作用靶點，對于進一步的研究具有重要的理論和現實意義。

[1] Bartel DP. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions[J]. Cell, 2009,136(2):215-233.

[2] Kim YJ, Hwang SH, Lee SY, et al. miR-486-5p induces replicative senescence of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells and its expression is controlled by high glucose[J]. Stem Cells Dev, 2012,21(10):1749-1760.

[3] Burova E, Borodkina A, Shatrova A, et al. Sublethal oxidative stress induces the premature senescence of human mesenchymal stem cells derived from endometrium[J]. Oxid Med Cell Longev, 2013, 2013：474931.

[4] Li J, Dong J, Zhang ZH, et al. miR-10a restores human mesenchymal stem cell differentiation by repressing KLF4[J]. J Cell Physiol, 2013,228(12):2324-2336.

[5] 黎 佼, 陳敏生, 楊偉健, 等. 年輕骨髓間充質干細胞可通過細胞融合改善年老骨髓間充質干細胞功能[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 26(5):976-981.

[6] Peng Y, Huang S, Wu Y, et al. Platelet rich plasma clot releasate preconditioning induced PI3K/AKT/NFκB signaling enhances survival and regenerative function of rat bone marrow mesenchymal stem cells in hostile microenvironments[J]. Stem Cells Dev, 2013,22(24):3236-3251.

[7] Seto AG. The road toward microRNA therapeutics[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2010,42(8):1298-1305.

[8] Bailey SG, Sanchez-Elsner T, Stephanou A, et al. Regulating the genome surveillance system: miRNAs and the p53 super family[J]. Apoptosis, 2010,15(5):541-552.

[9] Oh HK, Tan AL, Das K, et al. Genomic loss of miR-486 regulates tumor progression and the OLFM4 antiapoptotic factor in gastric cancer[J]. Clin Cancer Res, 2011,17(9):2657-2667.

[10]Peng Y, Dai Y, Hitchcock C, et al. Insulin growth factor signaling is regulated by microRNA-486, an underexpressed microRNA in lung cancer[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013,110(37):15043-15048.

[11]Valle-Prieto A, Conget PA. Human mesenchymal stem cells efficiently manage oxidative stress[J]. Stem Cells Dev, 2010,19(12):1885-1893.

[12]Herrmann JL, Markel TA, Abarbanell AM, et al. Proinflammatory stem cell signaling in cardiac ischemia[J]. Antioxid Redox Signal, 2009,11(8):1883-1896.

[13]Mangi AA, Noiseux N, Kong D, et al. Mesenchymal stem cells modified with Akt prevent remodeling and restore performance of infarcted hearts[J]. Nat Med, 2003,9(9):1195-1201.

[14]Small EM, O’Rourke JR, Moresi V, et al. Regulation of PI3-kinase/Akt signaling by muscle-enriched microRNA-486[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010,107(9):4218-4223.

[15]Xu J, Qian J, Xie X, et al. High density lipoprotein protects mesenchymal stem cells from oxidative stress-induced apoptosis via activation of the PI3K/Akt pathway and suppression of reactive oxygen species[J]. Int J Mol Sci, 2012,13(12):17104-17120.

[16]Lim SY, Kim YS, Ahn Y, et al. The effects of mesenchymal stem cells transduced with Akt in a porcine myocardial infarction model[J]. Cardiovasc Res, 2006,70(3):530-542.

Role of miR-486-5p in apoptosis of human bone marrow mesenchymal stem cells induced by hydrogen peroxide

HU Ming, LI Jiao, LIU Ning-ning, HUANG Zhen-jun, WU Chong-hai, ZHONG Yun, LIU Shi-ming

(TheSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,GuangzhouInstituteofCardiovascularDisease,Guangzhou510260,China.E-mail:gzliushiming@126.com)

AIM: To investigate the role of microRNA-486-5p (miR-486-5p) in the apoptosis of human bone marrow mesenchymal stem cells (hMSCs) induced by hydrogen peroxide (H2O2). METHODS: The hMSCs were culturedinvitroand exposed to serum-free medium and H2O2(10 mmol/L). The changes of miR-486-5p expression in oxidative stress-related apoptosis of hMSCs were measured by real-time PCR. The hMSCs were transfected with miR-486-5p mimic or inhibitor at concentration of 30 nmol/L by Lipofectamine RNAiMAX. The effect of miR-486-5p on H2O2-induced decrease in cell viability was evaluated by MTT assay. Hoechst 33342 staining and flow cytometry were applied to determine the role of miR-486-5p in the apoptosis of hMSCs. The protein expression was evaluated by Western blotting. Caspase-3 activity was determined using a caspase-3 activity kit. RESULTS: Compared with control group, the expression of miR-486-5p significantly decreased after treated with H2O2(P<0.05). In addition, over-expression of miR-486-5p in the hMSCs reduced the cell viability, accelerated apoptosis, down-regulated Bcl-2/Bax ratio, caspase-3 enzyme precursor content and phosphorylation of Akt, and activated caspase-3 activity. Conversely, down-regulation of miR-486-5p significantly inhibited H2O2-induced cell apoptosis and the caspase-3 activity, increased cell viability and up-regulated Bcl-2/Bax ratio and phosphorylation level of Akt. CONCLUSION: Over-expression of miR-486-5p promotes H2O2-induced hMSCs apoptosis, and repression of miR-486-5p protects hMSCs from H2O2-induced cellular apoptosis, which may be mediated by regulating Akt signaling pathway.

MicroRNA-486-5p; Mesenchymal stem cells; Oxidative stress; Apoptosis

1000- 4718(2015)03- 0524- 06

2014- 10- 28

2014- 12- 14

廣州市屬高校科研項目(No. 2012C230)； 廣東省科技計劃(No.2013B021800198)； 國家自然科學基金青年基金資助項目(No. 81401156)

△通訊作者 Tel: 020-34153522; E-mail:gzliushiming@126.com

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R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.024