microRNA-215對人視網膜母細胞瘤細胞生長及抑癌基因Rb1表達的調控作用

楊林聲，王理論，杜青衛(wèi)

（延安大學附屬醫(yī)院眼科，陜西 延安 716000）

microRNA-215對人視網膜母細胞瘤細胞生長及抑癌基因Rb1表達的調控作用

楊林聲，王理論，杜青衛(wèi)

（延安大學附屬醫(yī)院眼科，陜西 延安 716000）

目的 研究microRNA-215(miR-215)在視網膜母細胞瘤(RB)組織中的表達及其臨床意義，并探討其對RB細胞活力、增殖及凋亡的影響。方法采用qRT-PCR檢測51例RB患者及相應癌旁組織中miR-215的表達并分析其與患者臨床病理特征的相關性。在RB細胞中轉染miR-215類似物或miR-215抑制物，采用噻唑藍比色法(MTT)、溴脫氧尿苷(BrdU)細胞增殖分析、Caspase3活性檢測及流式細胞儀檢測細胞活力、增殖及凋亡的影響。Western blot檢測視網膜母細胞瘤蛋白1(Rb1)表達變化。結果miR-215在RB組織中的表達水平顯著高于對應的癌旁組織(P＜0.01)；miR-215表達與視神經浸潤(P=0.002)及分化程度(P=0.041)有關；miR-215在RB細胞系Y79及HXO-Rb44中的表達水平顯著高于其在正常視網膜血管內皮細胞ACBRI-181中的表達水平(P＜0.01)；miR-215抑制物顯著降低HXO-Rb44細胞中miR-215的表達水平并導致細胞活力降低、增殖能力下降、胞內Caspase3活性增加及凋亡細胞百分比增加；miR-215類似物顯著升高Y79細胞中miR-215的表達水平并導致細胞活力升高、增殖能力增強及凋亡細胞百分比降低。同時，下調HXO-Rb44細胞中miR-215水平顯著升高細胞內Rb1蛋白表達水平，過表達Y79細胞中miR-215水平顯著降低細胞內Rb1蛋白表達水平。結論miR-215在視網膜母細胞瘤組織中表達升高且與惡性臨床病理特征相關。miR-215可增強視網膜母細胞瘤細胞活力、增殖能力并減少細胞凋亡，并可降低細胞內Rb1蛋白表達，提示miR-215在視網膜細胞瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

MicroRNA-215；視網膜母細胞瘤；腫瘤生長；臨床意義

視網膜母細胞瘤(Retinoblastoma，RB)是發(fā)生于視網膜核層、具有家族傾向、多發(fā)于5歲以下嬰幼兒的一種惡性腫瘤[1-2]。該腫瘤易發(fā)生顱內和遠處轉移，常危及患兒生命[3-4]。因此，尋找RB早期診斷的生物學標志物，探明其發(fā)生發(fā)展的分子信號機制并發(fā)現能有效抑制其發(fā)生發(fā)展的治療靶點，對提高RB的診治水平，改善患兒預后具有重要意義。在RB組織中，抑癌基因Rb1存在低表達，是導致RB發(fā)生的重要分子基礎[3]。研究表明，Rb1在RB組織中的低表達可能與基金突變、表觀遺傳修飾等多種分子機制有關[5]。然而，RB組織及細胞中microRNA的異常表達是否會導致Rb1低表達，進而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，目前仍不明確。

近年來的研究發(fā)現，microRNA-215(miR-215)在多種腫瘤組織中存在異常表達[6-8]，并在腫瘤增殖[6]、遷移及侵襲[7]等多種生物學功能中發(fā)揮重要功能。然而，miR-215在RB組織及細胞中的表達及生物學功能，以及其是否能夠抑制Rb1蛋白的表達，目前尚不明確。本課題通過檢測miR-215在視網膜母細胞瘤組織中的表達，分析其與RB患者臨床病理特征的關系，并應用人工合成的miR-215的抑制物和類似物探明miR-215在RB發(fā)生發(fā)展中的生物學功能及其對Rb1的調控作用，為將miR-215確立為RB的新生物學標志物和治療靶點理論基礎。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集西安交通大學第一附屬醫(yī)院眼科2001年1月至2014年12月經病理診斷為RB并行手術摘除眼球患者51例。51例患者的就診年齡為3個月至9歲，平均(3.2±1.9)歲；男性19例，女性32例；單眼20例，雙眼31例；分化型14例，未分化型37例；發(fā)生神經浸潤30例，未發(fā)生神經浸潤21例。術前均未接受化療及局部放療等治療。本研究獲得所有患者監(jiān)護人知情同意及醫(yī)院的倫理學審核。

1.2 實驗材料 RNA提取所用的TRIzol購自于美國Life Technologies公司；PrimeScript reverse transcription-PCR(RT-PCR)試劑盒購自Takara公司；TaqMan miRNA Reverse Transcription試劑盒及TaqMan Human MiRNA Assay試劑盒購自Applied Biosystems公司；人正常視網膜血管內皮細胞系ACBRI-181和視網膜母細胞瘤系Y79及HXO-Rb44購自于美國模式菌種收集中心(American Type Culture Collection，ATCC)；細胞培養(yǎng)所用的DMEM購自 Hyclone公司；細胞轉染用的脂質體Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；MiRNA質粒包括miR-215表達質粒(miR-215 mimics)、miR-215抑制質粒(miR-215 inhibitor)及其相應的對照質粒購自Genecopoeia公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒及Caspase-3活性檢測試劑盒購自凱基生物公司；兔抗人Rb1多克隆抗體及鼠抗人β-actin單克隆抗體購自Cell signaling公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實時熒光定量RT-PCR 根據TRIzol?操作說明書提取總RNA，應用RT-PCR試劑盒逆轉錄cDNA。使用TaqMan miRNA Reverse Transcription試劑盒(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)和TaqMan Human MiRNA Assay試 劑 盒 (Applied Biosystems)定量檢測miR-215表達。△△Ct法用于計算miR-215相對于U6的相對表達量。

1.3.2 細胞培養(yǎng) 人正常視網膜血管內皮細胞ACBRI-181和視網膜母細胞瘤Y79及HXO-Rb44培養(yǎng)于含10%胎牛血清(Gibco，USA)、1%青霉素/鏈霉素(Sigma，USA)的DMEM培養(yǎng)基(Gibco)中，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中，飽和濕度下培養(yǎng)。穩(wěn)定傳代2～3代后，取對數生長期細胞進行實驗。

1.3.3 質粒構建和轉染 使用Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)將miRNA質粒包括miR-215表達質粒(miR-215 mimics)、miR-215抑制質粒(miR-215 inhibitor)及其相應的對照質粒轉染視網膜母細胞瘤系細胞，并應用潮霉素篩選穩(wěn)定表達細胞株用于進一步實驗。

1.3.4 MTT法檢測細胞活力 取對數生長期的細胞，用培養(yǎng)基制備細胞數為1×105/ml的單細胞懸液，以200 μl/孔接種于96孔板。接種細胞24 h、48 h、72 h后MTT檢測細胞活力。在檢測細胞活力前4 h，每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT；孵育4 h后，吸出培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μl，于室溫輕微溶解結晶15 min。每個時間點設6個復孔。酶標儀在490 nm波長處檢測每孔的吸光值。

1.3.5 Brdu-ELISA法測定細胞增殖 取對數生長期細胞，用培養(yǎng)基制備細胞數為1×105/ml的單細胞懸液，以200 μl/孔接種于96孔板并進行細胞轉染。培養(yǎng)結束前每孔加入20 μl BrdU標記液，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。ELISA法檢測細胞增殖抑制：加BrdU培養(yǎng)結束后，加入Fix Denat使DNA變性，然后每孔加100 μl HRP標記的抗BrdU抗體，洗滌3次，每孔加入100 μl TMB底物液顯色，20 min后加1 mol/L H2SO4終止反應，置振蕩器上1 min，在酶標儀上以450 nm/630 nm雙波長檢測吸光值，即BrdU值。每組設3個副孔。

1.3.6 Caspase-3活性檢測試劑盒檢測Caspase-3的活性 胰酶消化轉染48 h后的細胞，800 r/min離心5 min棄掉胰酶。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次，2 000 r/min離心5 min，收集(3～5)×106個細胞。在收集的沉淀細胞中加入50 μl預冷的Lysis Buffer，并置于冰上裂解20～30 min，期間渦旋震蕩3～4次；隨后，將上述裂解液于4℃離心機以10 000 r/min離心1 min。吸取裂解液上清至新的EP管中，并置于冰上備用；取少量上清液，并用BCA法測定其中的蛋白濃度。吸取50μl含有100～200 μg蛋白的細胞裂解上清，并加入50μl的2×Reaction buffer，使用前每50μl的2×Reaction buffer加入0.5μl DTT；隨后加入5 μl Caspase-3 Substrate，并于37℃避光孵育4 h。利用酶標儀在405 nm波長處測定其吸光值。

1.3.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取轉染后48 h后的細胞，用0.01 mol/L PBS洗滌細胞，800 r/min離心5 min后棄去上清，用1×Binding buffer重懸細胞并調整細胞數為1×106/ml，每管加入500 ul細胞懸液、5μl Annexin V-FITC和10 μl PI。混勻室溫避光孵育20 min后，進行流式細胞儀檢測，每個樣本獨立重復3次。

1.3.8 Western blot利用RIPA試劑盒提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒(BCA kit)檢測蛋白樣品濃度。取40μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離后，利用濕轉儀將蛋白轉移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入5%牛血清蛋白(BSA)稀釋的Rb1多克隆抗體(1:1 000)及β-actin單克隆抗體(mAb，1:1 500)4℃孵育過夜后，加HRP標記二抗(1:10 000)，室溫孵育2 h。最后利用ECL化學發(fā)光劑暗室顯影。

1.4 統(tǒng)計學方法 使用SPPSS13.0和GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。兩組間計數資料比較采用χ2檢驗，計量資料以均數±標準誤(±s)表示，組間兩兩比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-215在RB組織及對應癌旁組織中的表達 應用qRT-PCR檢測miR-215在51例骨肉瘤及對應癌旁組織中的表達，結果提示miR-215在視網膜母細胞瘤組織中的表達水平顯著高于對應的癌旁組織[(1.170±0.255)vs(1.940±0.102)，t=2.800，P＜0.05]，見圖1。

圖1 miR-215在視網膜母細胞瘤及其對應瘤旁組織中的表達水平

2.2 miR-215表達水平與視網膜母細胞瘤患者臨床病例特征的相關性 將miR-215在視網膜母細胞瘤組織中的表達水平的中位值定為界值，miR-215表達水平低于中位值者歸為miR-215低表達組，miR-215表達水平等于或高于中位值的患者歸為miR-215高表達組。miR-215表達與視網膜母細胞瘤患者臨床病理特征之間的相關性詳見表1，結果顯示骨肉瘤組織中miR-215表達與視神經浸潤(χ2= 9.206，P=0.002)及分化程度(χ2=3.878，P=0.041)有顯著相關性。

表1 miR-215表達與RB患者臨床病理特征的關系（n=51）

2.3 miR-215在人視網膜母細胞瘤細胞中的表達水平 采用qRT-PCR檢測視網膜母細胞瘤細胞系Y79、HXO-Rb44和人正常視網膜血管內皮細胞ACBRI-181細胞中miR-215的表達。檢測結果表明：miR-215在Y79及HXO-Rb44中的表達水平顯著高于其在ACBRI-181細胞中的表達[(0.977±0.065)vs (1.770±0.047)，t=9.882，P＜0.01；(0.977±0.065)vs (2.510±0.102)，t=12.670，P＜0.01]，見圖2。

圖2 miR-215在人視網膜母細胞瘤細胞系及正常視網膜血管內皮細胞中的表達水平

2.4 下調miR-215導致HXO-Rb44細胞活力及增殖能力減弱，凋亡增加 為進一步研究miR-215在視網膜母細胞瘤中的生物學功能，將miR-215抑制物轉染HXO-Rb44細胞，進而檢測細胞活力、增殖能力及凋亡的變化。qRT-PCR檢測結果顯示：與對照組比較，miR-215抑制物能夠顯著下調HXO-Rb44細胞中miR-215的表達(P＜0.01，圖3A)。MTT實驗結果表明：下調miR-215的表達后，HXO-Rb44細胞活力顯著下降(P＜0.01，圖3B)；BrdU細胞增殖分析檢測細胞增殖能力變化顯示：下調miR-215導致HXO-Rb44細胞增殖能力顯著減弱(P＜0.05，圖3C)；另一方面，Caspase-3活性檢測表明：下調miR-215的表達后，細胞內Caspase-3活性顯著增加(P＜0.01，圖3D)；同時，流式細胞儀檢測細胞凋亡顯示：下調miR-215表達后，HXO-Rb44細胞的凋亡比例顯著增加(P＜0.01，圖3E)。

圖3 下調miR-215對HXO-Rb44細胞活力、增殖能力及凋亡的影響

2.5 上調miR-215導致Y79細胞活力及增殖能力增強，凋亡減少 為進一步證實miR-215調控細胞活力、增殖及凋亡的影響，進一步利用miR-215類似物轉染Y79細胞，進而檢測檢測細胞活力、增殖能力及凋亡的變化。qRT-PCR檢測結果顯示：與對照組相比，miR-215類似物轉染能夠顯著升高上調Y79細胞內miR-215的表達水平(P＜0.01，圖4A)；功能學實驗進一步表明：上調miR-215表達后，MTT結果顯示Y79細胞活力顯著增強(P＜0.05，圖4B)，BrdU細胞增殖分析表明細胞增殖能力顯著增強(P＜0.01，圖4C)， Caspase-3活性檢測提示細胞內Caspase-3活性顯著降低(P＜0.05，圖4D)，同時流式細胞儀檢測結果提示凋亡細胞比例顯著降低(P＜0.05，圖4E)。

2.6 miR-215調控視網膜母細胞瘤細胞中Rb1蛋白的表達RB1是重要的抑癌基因，Rb1蛋白低表達是視網膜母細胞瘤的重要特征，Rb信號調節(jié)途徑是一種主要的抑癌方式，在抑制細胞增生方面具有重要的作用。為探明miR-215能否下調HXO-Rb44細胞中Rb1蛋白表達進而發(fā)揮促進視網膜母細胞瘤發(fā)生發(fā)展的作用，進一步利用Western blot法檢測下調miR-215后HXO-Rb44細胞中Rb1蛋白的表達水平。檢測結果表明：下調miR-215表達后，細胞內Rb1蛋白的表達顯著增加(P＜0.01，圖5A)。另一方面，miR-215 mimics轉染后Y79細胞后，細胞內Rb1蛋白的表達顯著降低(P＜0.01，圖5B)。

圖4 過表達miR-215對Y79細胞活力、增殖能力及凋亡的影響

圖5 MiR-215對視網膜母細胞瘤細胞中Rb1蛋白的表達變化

3 討論

MiRNAs是細胞內一組長度較短的(約22個核苷酸)內源性非編碼RNA[9]，可通過與靶mRNAs的3'端非編碼區(qū)域的識別序列部分互補結合，最終導致mRNAs降解或翻譯受阻。越來越多的證據表明：miRNAs在多種細胞進程中發(fā)揮決定性作用[10-11]，如分化、形態(tài)發(fā)生和腫瘤發(fā)生。在人類腫瘤發(fā)生中，miRNAs可發(fā)揮促癌或者抑癌的生物學功能，并可作為腫瘤早期診斷及預后評估的有效生物學標志物[12]。本研究表明：相較于正常癌旁組織，miR-215在視網膜母細胞瘤組織中存在顯著高表達；同時，miR-215的異常高表達與患者的不良病理特征存在顯著相關性。這表明：miR-215可能作為視網膜母細胞瘤患者早期診斷及預后評估的潛在生物學標志物。

增殖能力增強及凋亡減少是腫瘤細胞的重要生物學特征，也是腫瘤發(fā)生進展的重要生物學基礎[13]。本研究的功能學實驗結果表明：上調miR-215后，視網膜母細胞瘤細胞的增殖能力顯著增強而凋亡顯著減少；下調miR-215后，其增殖能力顯著減弱而凋亡顯著增加。因此，這些研究結果表明：miR-215可以通過增強細胞增殖能力，減少細胞凋亡，進而發(fā)揮促進視網膜母細胞瘤發(fā)生發(fā)展的生物學功能。

在哺乳動物體內，抑癌基因RB缺失、突變及表達減少在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[5]，如視網膜母細胞瘤、肺癌、胃癌、膀胱癌及乳腺癌等。同時，大量研究表明miRNAs表達或功能異常是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因[9-10]。miRNAs可通過下調腫瘤內抑癌基因的表達或上調促癌基因的表達而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在胃癌中的研究表明，miR-215能夠下調胃癌組織中Rb1蛋白的表達，進而發(fā)揮增強胃癌細胞增殖的作用[6]。本研究的實驗數據表明：上調miR-215后，視網膜母細胞瘤細胞中Rb1蛋白的表達顯著降低，而下調miR-215后，細胞內Rb1蛋白表達顯著增高。這提示miR-215能夠通過抑制細胞內Rb1蛋白的表達而發(fā)揮促進視網膜母細胞瘤發(fā)生發(fā)展的作用。

總之，本研究證實：在視網膜母細胞瘤組織中miR-215表達顯著增加且與患者不良臨床病理特征相關；miR-215可發(fā)揮促進視網膜母細胞瘤細胞增殖能力及抑制其凋亡的能力；同時，miR-215能夠顯著抑制細胞內Rb1蛋白的表達。本研究結果表明miR-215有望成為視網膜母細胞瘤早期診斷和預后評估的標志物，并可能成為視網膜細胞瘤基因治療的潛在靶點。

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Regulatory effect of MicroRNA-215 on the growth of human retinoblastoma cells and the expression of Rb1.

YANG Lin-sheng,WANG Li-lun,DU Qing-wei.Department of Ophthalmology,the Affiliated Hospital of Yan'an University,Yan'an 716000,Shaanxi,CHINA

ObjectiveTo investigate the clinical significance and functional role of microRNA-215 (miR-215)in retinoblastoma(RB)tissues and cells,and to analyze the effect of miR-215 on cell viability,proliferation and apoptosis.MethodsWe detected miR-215 expression in 51 samples of RB and the matched normal tumor-adjacent tissues using qRT-PCR.The expression level of miR-215 was altered by corresponding vectors(miR-215 inhibitor and miR-215 mimic)in RB cells.And then MTT,BrdU cell proliferation,Caspase3 activity and flow cytometry assay were performed to examine the viability,proliferation and apoptosis of RB cells.Western blot was used to detect thealteration of Rb1 expression after the over-expression or down-expression of miR-215.ResultsThe expression level of miR-215 in RB tissues was significantly higher than that in normal tumor-adjacent tissues(P＜0.01).The expression of miR-215 in tumor tissues was significantly associated with optic nerve infiltration(P=0.002)and differentiated degree(P=0.041).The expression levels of miR-215 in RB cell lines Y79 and HXO-Rb44 were significantly higher than that in retinal microvascular endothelial cells ACBRI-181(P＜0.01).MiR-215 expression was significantly inhibited by miR-215 inhibitor in HXO-Rb44 cells,and down-expression resulted in significantly decreased cell viability and proliferation,as well as increased apoptosis.On the contrast,MiR-215 expression was significantly improved by miR-215 mimic in Y79 cells,and the over-expression led to significantly increased cell viability and proliferation,as well as decreased apoptosis.Besides,the down-expression of miR-215 in HXO-Rb44 cells significantly increased the level of Rb1,while the over-expression of miR-215 in Y79 cells significantly decreased the level of Rb1.ConclusionIncreased expression of miR-215 is correlated with the adverse clinicopathological features of retinoblastoma.MiR-215 may regulate cell viability,proliferation and apoptosis of retinoblastoma cells by targeting Rb1, suggesting miR-215 may play a key role in the development and progression of retinoblastoma.

MicroRNA-215;Retinoblastoma;Tumor growth;Clinical significance

R739.7

A

1003—6350（2015）24—3592—06

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.24.1300

2015-07-26)

陜西省科技廳項目（編號：2013KJXX31）

王理論。E-mail：yanglinsheng783@163.com