手足口病患者柯薩奇病毒核酸檢測結果分析*

王武琦，蘇國生，韋善求(.廣西壯族自治區玉林市中醫醫院檢驗科 537000；.廣西壯族自治 區南寧市第四人民醫院/廣西醫科大學附屬南寧市傳染病醫院/廣西艾滋病臨床治療中心，南寧53003)

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·論 著·

手足口病患者柯薩奇病毒核酸檢測結果分析*

王武琦1，蘇國生2△，韋善求2(1.廣西壯族自治區玉林市中醫醫院檢驗科 537000；2.廣西壯族自治 區南寧市第四人民醫院/廣西醫科大學附屬南寧市傳染病醫院/廣西艾滋病臨床治療中心，南寧530023)

目的 探討手足口病患者柯薩奇病毒核酸檢測的臨床應用價值。方法 利用實時熒光聚合酶鏈反應技術，以EV71/CA16基因組編碼區的高度保守區為靶區域，設定特異性引物及熒光探針，通過一步法RT-PCR擴增對EV71 RNA/CA16 RNA進行檢測。結果 在428份患者標本中，EV71-RNA陽性136份，CA16-RNA陽性6份，其中有1例患者既是EV71-RNA咽拭子和肛拭子均陽性又是CA16-RNA咽拭子陽性。而有40例(80份標本)患者EV71-RNA咽拭子和肛拭子均陽性，46份EV71-RNA單獨肛拭子陽性，10份EV71-RNA單獨咽拭子陽性。在6份CA16-RNA陽性患者標本中，4份為肛拭子陽性，2份為咽拭子陽性。結論 手足口病患者柯薩奇核酸檢測對重癥患者判斷預后有重要的指導意義，對指導臨床合理制訂治療方案有重要的參考價值，值得推廣應用。

手足口病； 柯薩奇病毒； 核酸檢測； 基因

近幾年來，玉林市手足口病的暴發流行有著逐年上升的趨勢，并且已經成為當前玉林市兒童急性傳染病的重要疾病，防控工作非常嚴峻。發病范圍由點到面，迅猛增長，患病兒童病死率也呈逐年增高的發展趨勢。由于手足口病的傳播途徑非常復雜，病原體種類繁多，且目前沒有相應的疫苗可以預防，因此至今沒有較好的預防控制措施[1-3]。手足口病是由多種腸道病毒感染引起的一種常見傳染病，在核酸分型中主要以EV71型和CA16型最多見。多以嬰幼兒發病最高，隨著疾病的發展，10～18歲的兒童感染的概率也屢見不鮮，大多數患者發病癥狀較輕，以發熱和口腔、手、足、臀部等部位的皮疹或皰疹為主要特征，部分患兒有咳嗽、惡心、嘔吐、食欲不振、流涕和頭疼等癥狀，少數患者可并發嚴重的心肌炎,無菌性腦膜炎以及肺水腫等致命性并發癥[4-5]。廣西醫科大學附屬南寧市傳染病醫院作為南寧市唯一一家綜合性三級傳染病醫院，一直是本市手足口病的定點治療醫院。為了解2012年廣西醫科大學附屬南寧市傳染病醫院柯薩奇病毒核酸檢測的結果及臨床應用，現將檢測相關情況報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年在本院住院治療的214例手足口病患兒咽拭子和肛拭子共計428份標本進行核酸檢測，患兒年齡4個月至10歲，平均年齡1歲零8個月，男性多于女性，本年度感染高發期在4～8月。感染患兒以散居兒童為主，其次為幼托兒童，最后為學生。

1.2 核酸檢測方法 利用實時熒光聚合酶鏈反應(PCR)技術，以EV71/CA16基因組編碼區的高度保守區為靶區域，設定特異性引物及熒光探針，通過一步法逆轉錄PCR擴增對EV71 RNA/CA16 RNA進行檢測。

1.2.1 標本采集 (1)咽拭子樣本：采集患者發病3 d內的咽拭子樣本，用專用采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側扁桃體部位，應避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有3～5 mL保存液(維持液或生理鹽水，推薦使用維持液)的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，以防干燥。(2)肛拭子樣本：采集患者發病7 d內的肛拭子樣本，采樣方法同咽拭子。(3)皰疹液：可同時采集多個皰疹作為1份樣本。先用75%乙醇對皰疹周圍的皮膚進行消毒，然后用消毒針將皰疹挑破用棉簽蘸取皰疹液，迅速將棉簽放入內裝有3～5 mL保存液(維持液或生理鹽水，推薦使用維持液)的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封。(4)標本保存和運送：標本可立即用于測試，也可保存于-40 ℃待測，保存期為4個月。長期保存，請置于-70 ℃。標本運送時應采用0 ℃冰壺。

1.2.2 樣本處理及RNA提取 (1)拭子樣本強烈振蕩1 min，取100 μL(待測樣本不足100 μL時請補加適量生理鹽水重懸)，放置于1.5 mL滅菌離心管，加入200 μL Trizol試劑及100 μL氯仿，用振蕩器強力振蕩20 s后靜置3 min，然后12 000 r/min離心2 min。(2)小心取出無色上層液體(注意不可觸及中間絮狀層)，轉移至新滅菌的1.5 mL離心管，然后加入10 μL RNA提取液A(充分混勻后吸取)，再用振蕩器充分混勻，8 000 r/min離心1 min后，小心棄去所有液體。(3)加入溶液C(確認已加入無水乙醇)400 μL，充分振蕩混勻，8 000 r/min離心1 min，盡可能將液體去除干凈(避免觸及沉淀顆粒)。(4)將裝有沉淀的離心管擺在通風櫥中風干15 min(也可使用開放式加熱器于60 ℃ 干燥5 min，需防止樣本交叉污染)，然后加入30 μL DEPC H2O，吸打混勻管中沉淀，得到白色的懸濁液，可直接用于檢測，也可存于-70 ℃待用。

1.2.3 注意事項 PCR 熒光定量檢測法比較容易受污染，所以試驗過程中應盡量避免反復開蓋，所用耗材均需高壓滅菌；RNA 提取步驟建議冰上操作；吸取血清/血漿時注意勿帶入紅細胞；試劑使用前要完全解凍，但應避免反復凍融；RNA 提取液A必須充分混勻后吸取，RNA 提取液B需溶解混勻后使用；逆轉錄成 cDNA后，需馬上進行下一步試驗，否則請轉移上清至滅菌EP管，保存于-20 ℃待用；試驗完畢應用有效氯濃度為1 000 mg/L的健之素消毒液擦拭桌面，打開紫外線燈消毒 30 min以上。

2 結 果

在428份患者標本中，EV71-RNA陽性136份，CA16-RNA陽性6份，其中有1例患者既是EV71-RNA咽拭子和肛拭子均陽性又是CA16-RNA咽拭子陽性。而有40例(80份標本)患者EV71-RNA咽拭子和肛拭子均陽性，46份EV71-RNA單獨肛拭子陽性，10份EV71-RNA單獨咽拭子陽性。在6份CA16-RNA陽性患者標本中，4份為肛拭子陽性，2份為咽拭子陽性。在214例患者中有6例由于病情嚴重送入ICU進行治療，有3例患者EV71-RNA咽拭子和肛拭子均陽性并有1例包含了CA16-RNA咽拭子陽性。此3例患者由于轉入ICU后病情繼續加重，醫治無效病死，其余單純1份標本EV71-RNA陽性患者病情好轉救治成功。

3 討 論

由柯薩奇病毒引起的手足口病是一種風險較高的傳染病，其預防控制措施多以控制傳染源為主，切斷傳播途徑并進行廣泛深入的手足口病防治健康教育，提高廣大群眾的自我保護意識[6]。當前本地區手足口病的防控工作主要還是切斷傳播途徑、保護易感人群。在以往經驗和防控措施的基礎上，進一步完善各項防控措施，堅持不懈抓落實。加大傳染源歸口管理，嚴格按照規定隔離患者和疑似患者，減少接觸傳播，減少第2代患者發生；加強區域小學及托幼機構的管理，堅持晨檢和消毒工作，發現可疑病患需及時報告并隔離；加強手足口病的防治宣教工作，將防控措施及方法傳達給每位兒童家長；做好調查研究及科研工作，尋求更好的防控方法。

柯薩奇病毒作為一種單股正鏈小RNA病毒，其基因長度為7.4 kb，堿基對(G+C)的濃度大約為47%。兩端為保守的非編碼區，中間為編碼區[7]。5′端以共價鍵結合1個小分子蛋白質Vpg(約7×103)，其作用與病毒RNA的合成和基因的組裝配有關；3′端則帶有polyA尾。編碼區編碼的病毒結構蛋白VP1～VP4與CoxV、EV71一樣，VP1、VP2和VP3均暴露在病毒衣殼的表面，具有中和抗原位點；VP4位于衣殼內部，病毒VP1一旦與受體結合后，VP4即被釋出，衣殼松動，病毒基因組脫殼穿入[8]。5′非編碼區沒有多聚嘧啶區和多聚C區。柯薩奇病毒在氣候變暖的季節里，容易污染環境，適合生存在濕、熱的環境下并瘋狂地傳播；病毒比較耐熱，失活溫度在50 ℃以上，在4 ℃下可存活1年以上，而在-20 ℃下可長期保存，因此，在常規環境下可長期存活[9]。柯薩奇病毒存在核苷酸多態性或毒力位點的變異性。免疫功能不全的嬰幼兒易感染，只要接觸被病毒污染的外環境，就有可能被感染[10]。由于嬰幼兒皮膚膚質較嫩，暴露部位較多，防護能力差，病原極易侵入機體而感染。

本研究結果顯示，手足口病患者柯薩奇病毒核酸檢測結果發現基因型EV71-RNA感染率較高，而CA16-RNA感染率較低，但從病情發展情況看，CA16-RNA感染的嚴重程度較高，很難進行救治，往往病情加重并發心肌炎而病死。另外，EV71-RNA咽拭子和肛拭子同時陽性的患者，其病情也較單一標本陽性者嚴重，更難醫治，病死的危險率增高。由此可見，可疑手足口病患者，入院后及時進行柯薩奇病毒核酸檢測，了解核酸的多態性和變異性，更有利于病患的救治。

綜上所述，手足口病患者柯薩奇核酸檢測在臨床上具有重要的臨床意義，對重癥患者而言，病原學的診斷對判斷預后和指導臨床合理制訂治療方案有重要的參考價值，值得推廣應用。

[1]海巖,王文瑞,郭衛東，等.內蒙古地區2010年柯薩奇病毒A組16型VP1區序列測定及系統進化分析[J].中華流行病學雜志,2013,34(5):539-540.

[2]梅玉發,王喜云,崔龍，等.湖北省十堰市59例柯薩奇病毒A組6型手足口病流行病學特征與臨床特點分析[J].疾病監測,2013,28(12):981-983.

[3]張建華,江炳福,程險峰，等.腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型分離株的VP1基因特征分析[J].東南大學學報：醫學版,2013,32(2):173-179.

[4]楊國梁,馬超鋒,陳海龍，等.2013年西安地區柯薩奇病毒A6流行情況及基因特征[J].西安交通大學學報：醫學版,2014,35(4):486-489.

[5]高勇,韓明鋒,李秀勇，等.阜陽市2011年手足口病實驗室檢測結果分析[J].檢驗醫學,2013,28(9):796-800.

[6]宋建,都鵬飛,程邦寧，等.合肥市0～14歲人群柯薩奇病毒A組16型和腸道病毒71型的感染狀況調查[J].安徽醫科大學學報,2014,21(7):1013-1015.

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[8]許國章,倪紅霞,易波，等.浙江省寧波市2008～2011年手足口病流行病學及病原學特征分析[J].中華流行病學雜志,2013,34(4):361-365.

[9]譚徽,謝群,何清懿，等.湖南省郴州市2009～2011年手足口病流行病學特征研究[J].現代預防醫學,2014,41(2):329-332.

[10]梁勇彪,屈雅川,曹棨，等.手足口病感染病毒分布及感染趨勢評估[J].中華醫院感染學雜志,2013,23(22):5485-5487.

Analysis on results of Coxsackie virus nucleic acid detection in HFMD patients*

WANGWu-qi1,SUGuo-sheng2△,WEIShan-qiu2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,YulinMunicipalHospitalofChineseMedicine,Yulin,Guangxi537000,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,NanningMunicipalFourthPeople′sHospital/GuangxiAIDSClinicalTreatmentCenter,Nanning,Guangxi530023,China)

Objective To investigate the clinical application value of Coxsackie virus nucleic acid detection in the patients with hand-foot-mouth disease(HFMD).Methods The real-time fluorescent PCR technology was adopted,with a highly conserved region of EV71/CA16 genomic coding regionas the target area,the specific primers and fluorescent probes were set,EV71 RNA/CA16 RNA was detected by the one-step method of RT-PCR amplification.Results In 428 patients samples,136 cases were EV71-RNA positive,6 cases were CA16-RNA positive,including 1 case of EV71-RNA positive in throat swabs and anal swabs and CA16-RNA positive in throat swab.And there were 40 cases (80 specimens) of EV71-RNA positive in swabs and anal swabs,46 cases of single EV71-RNA positive in anal swab,10 cases of single EV71-RNA positive in throat swabs.In 6 cases of CA16-RNA positive specimens,4 cases were positive in anal swab,two cases were positive in throat swab.Conclusion The Coxsackie nucleic acid testing in HFMD patients has an important guiding significance for judging the severe patients and their prognosis and has an important reference value for guiding clinic to formulate the treatment plan.

foot and mouth disease; coxsackie virus; nucleic acid detection; gene

廣西壯族自治區衛生廳自籌經費科研課題(Z2010483)。

王武琦，女，本科，主管技師，主要從事臨床醫學檢驗研究。

△通訊作者，E-mail：suguoshengv@sina.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.18.016

A

1672-9455(2015)18-2688-02

2015-04-15

2015-05-25)