肝癌干細胞的細胞分子標志物和信號通路的研究進展

鄭 磊，張學彥，孔令建

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綜 述

肝癌干細胞的細胞分子標志物和信號通路的研究進展

鄭 磊，張學彥，孔令建

癌,肝細胞；干細胞研究；信號傳導

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上第7種常見腫瘤，在我國位列腫瘤的第2位，僅次于肺癌，尤其在亞洲和非洲等受肝炎病毒影響嚴重的地區死亡率很高[1]。HCC的常規治療方法有多種：如外科手術治療、肝動脈插管栓塞化療(TACE)、射頻消融(RFA)和化療藥物治療等，但各種方法都有其治療的局限性[2]。目前，肝癌靶向治療正在不斷地取得進展，分離和鑒定特異性肝癌干細胞(liver cancer stem cells, LCSCs)的表面分子標志物，對探索肝癌的發病機制以及開展靶向治療至關重要。由于LCSCs的特異性標記物還未被發現，只能根據LCSCs的干細胞所具有特異性的表面標志物來篩選其非特異性表面標志物。近來發現肝癌內部的一些信號轉導通路的異常激活或抑制與肝癌的發生有著密切的聯系。本文就肝癌相關的分子標志物和信號轉導通路的研究進展作一綜述。

1 肝癌干細胞分子標志物

目前，實驗研究確定為肝癌干細胞分子標志物的有：CD133、乙醛脫氫酶、CD90、CD44、CD13、OV6、K19、c-kit、ABCG2、SALL4等。

1.1 CD133 CD133分子是一種5次跨膜糖蛋白，又被命名為prominin-1和AC133。研究發現，CD133(+)肝癌細胞具有明顯的自我更新、分化和增值的能力，包括其分化成非肝細胞樣譜系的能力和自我更新的能力[3]。采用免疫組化檢測人肝癌手術標本，發現肝癌組織中頻繁出現CD133(+)腫瘤細胞，高表達的CD133細胞占40%。有關臨床資料分析顯示，CD133的高表達更能體現出干細胞的自我更新、增殖的潛能與移植入免疫缺陷的小鼠后形成腫瘤的能力[4]。目前有實驗研究發現肝癌細胞系Huh-7中CD133(+)細胞高表達，并且比CD133(-)細胞表現為體外更強的增殖潛能和更低的分化程度。研究還顯示CD133(+)肝癌細胞成瘤能力與MAPK/PI3K信號通路的異常激活相關[5]。

1.2 乙醛脫氫酶(Aldehyde dehydrogenase,ALDH) ALDH主要存在于人體肝臟和腎臟細胞中，此類酶主要參與乙醇和乙醛的代謝。ALDH參與調節細胞的增殖，并在腫瘤干細胞中高表達，是一種新型的腫瘤干細胞標志物[6]。通過對ALDH和CD133相關的實驗分析發現，ALDH的亞型表達與CD133表達呈正相關，不同的亞型表達與它們的致瘤能力密切相關，致瘤能力從高到低依次為：CD133(+)ALDH(+)>CD133(+)ALDH(-)>CD133(-)ALDH(-)，因此，聯合檢測這兩種表面標記物對HCSCs致瘤性有著重要的意義[7]。最近實驗表明，雖然CD133(+)ALDH(+)在肝癌細胞中致瘤性最高，但其在肝癌中所占的比率很低[8]。

1.3 CD90 CD90又稱為Thy-1，是卵圓細胞的表面標志物。在裸鼠移植實驗中發現，從人類肝癌細胞系分離出來的CD90(+)在免疫缺陷的小鼠體內可以成瘤，而CD90(-)無成瘤性[9]。最新研究發現，在肝癌標本中分離到了CD45(-)CD90(+)細胞，這些細胞在裸鼠體內顯示出了致瘤特性，因此對CD45(-)CD90(+)這兩種標志物的聯合檢測對肝癌診斷有一定的意義[10]。以上實驗提示，CD90是一個較理想的LCSCs的候選標志物，將來可能發展成為新的治療靶點。

1.4 CD44 CD44是由單基因編碼的糖蛋白家族，目前作為實體腫瘤干細胞的重要標志物，它參與細胞與基質的粘連、組織重塑和細胞遷移。通過實驗發現CD90(+)CD44(+)細胞惡性程度比CD90(+)CD44(-)細胞高，抑制CD44表達可阻止其種植瘤的形成[9]。實驗證實CD133(+)CD44(+)細胞具有干細胞的特性。進一步研究表明CD133(+)CD44(+)肝癌細胞較CD133(+)、CD44(-)細胞呈現出更強的體內致瘤性[11]。因此對CD133(+)CD44(+)這兩種標志物的聯合檢測對鑒定LCSCs有著積極的意義。

1.5 CD13 CD13又稱氨肽酶N，早期被定義為髓樣細胞表面標志物，它參與細胞的多個生物學過程，后經研究發現它是肝癌起源以及半數靜止期HCSCs的標志物。實驗通過對肝癌細胞系Huh7的側群細胞進行分析，發現CD13高表達，而且CD13(+)主要存在于G1/G0期，治療后，這些幸存的細胞通常在癌灶內形成細胞群[12]。隨后的實驗也發現，CD13(+)細胞致瘤能力較強，用化療藥物5-FU處理后，仍表現出顯著的耐藥性。實驗通過使用CD13中和抗體下調CD13發現，可以成功地誘導肝癌細胞的凋亡[13]。以上實驗說明，CD13通過其蛋白水解功能，干擾抗原呈遞，逃避免疫識別，在腫瘤細胞的形成和發展中扮演重要的角色。

1.6 OV6 OV6是肝祖細胞的表面標志物。通過對218位OV6(+)的肝癌患者標本時發現，肝癌中OV6(+)患者預后不良，表現出侵襲性和致瘤性的升高，與其臨床病理特征密切相關。OV6(+)的肝癌患者的總體生存率和無瘤生存率較低。進一步的實驗發現OV6(+)細胞組會形成更多的微轉移病灶，而OV6(-)組則未發現有轉移，并且觀察到了OV6(+)細胞存在于肺轉移灶中，而且OV6(+)細胞與OV6(-)細胞比較表現出更強的體內成瘤性[14]。目前，作為HCSCs的表面標志物之一，關于OV6的研究較少，有待進一步的研究。

1.7 K19 K19是一種膽管型細胞角蛋白。研究人員采用微陣列研究方法對肝癌干細胞性相關蛋白表達進行研究，發現K19(+)常與CD133、EpCA等干細胞性相關蛋白聯合出現，并表現出更強的致瘤性。K19(+)細胞與K19(-)細胞相比，與AFP的水平、腫瘤的惡性程度、血管的侵犯密切相關。此外，實驗也證實，K19(+)表達的肝癌患者總生存期和無病生存期較短，而表達K19(-)的患者則體現不明顯[15]。所以，聯合檢測K19(+)、CD133和EpCA對肝癌的診斷和治療有著積極的意義。

1.8 c-kit c-kit又稱干細胞因子受體(CD117)、肥大細胞因子受體，作為III型跨膜受體蛋白酪氨酸激酶受體的蛋白家族成員之一，與各類細胞的異常增殖有密切關系。有免疫組化研究已表明，c-kit廣泛表達于HCC中，數量約在2.4%～80%[16]。也有報道稱，c-kit高表達在腫瘤患者中體現出存活期長，預后較好[17]。由于c-kit受體與肝癌的發生、發展密不可分，目前，針對其的臨床藥物的有效性也表明，它也將成為肝癌治療的潛在靶點。

1.9 ABCG2 ABCG2即三磷腺苷結合盒轉運蛋白G2，在各種腫瘤細胞及正常組織干細胞中高表達，它也廣泛表達于側群細胞中，被認為是干細胞的通用標志物。有實驗采用化療藥物作用和RNA干擾技術使ABCG2水平下降，表現為癌細胞增殖能力明顯下降，說明ABCG2 可能通過主動外排抗腫瘤藥物或其他機制來影響腫瘤的增值能力[18]。而ABCG2能否作為肝癌治療的新靶點需要進一步的研究。

1.10 SALL4 SALL4是與果蠅基因同源的人類基因，包括SALL4A和SALL4B兩個亞型，其可以編碼鋅指轉錄因子C2H2[19]。它在全能性胚胎干細胞自我更新維護中起關鍵性作用，并且與Nanog基因、Sox2和Oct4起相互作用[20-21]。最新研究顯示，SALL4被認為是肝癌的一種亞型的標志物，與肝癌的預后不良有關[22]。

2 肝癌干細胞的相關信號通路

肝干細胞的自我更新和表型特征的多樣化需要大量的信號來維持，這些信號包括Wnt /β-catenin信號通路、Hedgehog(Hh)信號通路、轉化生長因子β、EpCAM和Notch信號通路，它們在干細胞的調節和腫瘤的形成中起著決定性作用。這些通路的異常激活可導致腫瘤的形成[23]。

2.1 Wnt/β-catenin信號通路 Wnt/β-catenin信號通路是Wnt經典信號通路之一，目前研究的比較透徹。它由β-catenin基因、Wnt蛋白、Wnt蛋白配體frizzled蛋白、相關調控蛋白構成。Wnt/β-catenin信號通路是細胞的生長、發育、再生和自我更新的正常過程，它在進化上是保守的[24]。最新研究發現，在約85%的肝癌中可以檢測到β-catenin的異常，其與Wnt/β-catenin信號通路異常活化有關[25]。

2.2 Hedgehog(Hh)信號通路 Hedgehog(Hh)信號通路控制細胞的增殖、分化和組織形成等過程，在肝癌的形成過程中起著調控的作用。Hh信號通路主要由核轉錄因子Gli以及下游目的基因、Hedgehog配體、2個跨膜蛋白受體Ptch和Smo組成。激活Hh信號通路時，Hh配體與Ptch受體結合,以自分泌或旁分泌的方式釋放Smo，隨后Smo進入細胞質，激活下游轉錄因子Gli，從而調控細胞生長、增殖和分化。此通路在成熟肝組織中無表達，而在肝癌中異常激活[26-27]。研究人員通過小分子抑制劑作用于靶點Gli基因，通過上調p27和下調c-myc、Bcl-2的表達，阻斷Gli蛋白轉錄，對細胞周期進行調節，從而抑制肝癌細胞的生長[28]。

2.3 轉化生長因子β 轉化生長因子β(TGF-β)是一組調節細胞生長和分化的超家族分子(targeting the TGF-beta signaling pathway in disease)，它由結構相近、功能類似的多肽組成。在人體發育和生長過程中，TGF-β參與了原癌基因表達、傷口愈合、胚胎發育等階段，它的異常表達與慢性肝炎、肝纖維化、酒精性肝病及肝癌等疾病有關[29]。在HCC中，TGF-β表現出抑制癌細胞增殖和增強癌細胞遷移黏附能力的雙向調節作用，在HCC患者中發現，Smad3的磷酸化反應會因TβRⅡ的表達減少而抑制，由此表明了TGF-β信號通路的信號強度下調。實驗結果表明，外源性TGF-β1刺激后，HCC細胞的生長受到TGF-β/Smads信號通路的抑制，然而敲除TβRⅡ后，自分泌型TGF-β不但對HCC細胞的生長沒有表現出抑制，反而有利于其存活[30]。

2.4 EpCAM EpCAM又稱為CD326，是一種新的腫瘤干細胞特征的表面標志物，它在正常成人肝臟組織中不表達，而在肝癌組織和肝干細胞中高表達，可通過促進細胞增殖、免疫逃逸等機制促進腫瘤的發生[31]。有研究發現，肝癌組織中的EpCAM(+)細胞具有自我更新、多向分化能力等干細胞特征，參與并引導肝癌細胞的生長和轉移[32]。EpCAM也可通過Wnt信號通路活化細胞，使靶細胞轉錄和翻譯，進而增殖，從而參與調控細胞周期。近年來更多研究發現EpCAM(+)細胞亞群更容易形成細胞群落，較EpCAM(-)細胞亞群具有更為顯著的成瘤能力[33]。目前，EpCAM的作為肝癌的干細胞治療潛在靶點的研究越來越多。

2.5 Notch信號通路 Notch信號通路雖然在進化過程中是高度保守的，但它也參與多種惡性腫瘤的發生、發展及轉移[34]。有研究證明，Notch信號誘導的肝癌細胞凋亡可能與蛋白磷酸激酶途徑有關，誘導肝癌細胞周期可能會導致Notch1的停滯和凋亡，進而抑制肝癌細胞生長[35]。最新實驗證明，下調Notch信號通路可以抑制肝癌細胞的生長，并且誘導其凋亡[36]。綜上所述，肝癌細胞中存在Notch信號通路的失活，腫瘤的發生與Notch受體表達的異常有關，但是其在肝癌發生、發展及轉移中的確切機制尚未明確，尤其是Notch信號通路在肝癌中起促癌作用還是抑癌作用尚有爭議。因此，Notch信號通路對肝癌增殖的影響尚需進一步研究。

3 展望

目前，雖然研究人員已發現幾種表面標志物可以用于分離、鑒定HCSCs，但是關于HCSCs標志物的研究還只局限于從正常肝干細胞的表面標志物去推定，因此，需要進一步的研究發現更多的、更特異的標志物來鑒定和分離HCSCs。HCC的發生、發展是一個多因素影響的復雜病理過程，已知多因子和多種信號通路共同參與其中，但是關于HCC發生的具體機制仍未明了，因此對其相關的多種信號通路的進一步研究顯得尤為重要。今后，隨著分子生物學的發展，對HCC的表面標志物和相關信號通路的研究越來越多，必將會發掘出更多潛在的HCC靶向治療途徑，為肝癌患者的治療帶來福音。

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