正交試驗法優選真武湯的微波提取工藝

任燕　何興會

[摘 要] 目的：優選出真武湯的微波提取最佳工藝。方法：采用微波提取方法，通過單因素實驗和正交實驗兩者結合考察了乙醇提取濃度、提取時間、微波火力、料液比對真武湯中芍藥苷得率的影響，從而優選出最優提取工藝。結果：真武湯提取工藝最佳條件為：乙醇濃度為60%，微波時間為3min，微波火力中高火，料液比為1∶10。結論：本研究將為真武湯的劑型開發等進一步研究奠定基礎。

[關鍵詞] 真武湯；芍藥苷；微波提取；正交實驗

[中圖分類號]R284.2 [文獻標志碼] A [文章編號]1007-8517（2015）06-0008-02

真武湯出自《傷寒論》，系張仲景針對少陰腎陽虧虛，氣不化水，水氣內停而設。全方由炮附子、白術、茯苓、生姜、芍藥等五味藥組成，具有扶陽抑陰、化氣行水的效果，適用于脾腎陽虛、水氣內停等證，為溫陽利水之經典方。后世醫家對本方進行了較為系統的研究，目前已突破了水病的范圍，用本方治療多個系統的疾病，如：慢性支氣管炎、肺氣腫、肺心病、風心病、冠心病、充血性心力衰竭、慢性胃腸炎、肝硬化腹水、慢性腎炎、內耳性眩暈、血栓閉塞性脈管炎等疾病，療效令人滿意。該方雖應用很廣，但對該方的提取工藝還未見有研究，從而也制約該方的制劑開發，故本文通過單因素及正交試驗對真武湯的提取工藝作初步研究，以期能為開發該方新制劑奠定一定基礎。

1 儀器和試劑

1.1 儀器 WP700L17微波爐；電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；UV-VIS分光光度計（UV-2450，日本島津公司）；高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；數顯恒溫水浴鍋（上海浦東光學儀器廠）。

1.2 材料 芍藥苷標準品（中國藥品生物制品鑒定所）；所用試劑均為分析純；中藥材炮附子、白術、茯苓、芍藥購于貴陽市藥材公司，生姜購于菜市場；炮附子、白術、茯苓、芍藥用粉碎機粉碎得藥材粗顆粒；生姜切塊，備用。

2 方法

2.1 芍藥苷含量得率的測定方法

2.1.1 標準品的制備 精密稱取100℃干燥恒重的芍藥苷標準品4.8mg于25ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得0.1920mg/ml標準儲備液。精密量取0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5ml分別置于10ml容量瓶中，編號為1、2、3、4、5、6，加入甲醇定容至10ml，搖勻，甲醇做空白對照。

2.1.2 芍藥苷標準曲線的制作 將配制好的對照品溶液進行波長確定，選出最大波長，最后確定最大波長為230nm。在230nm波長處測定吸光度，以濃度對吸收值做線性回歸，得出回歸方程：Y=30.007X-0.0273，R2=0.9994，其中X是芍藥苷標準品的濃度，Y是吸光度值。

2.1.3 供試品的制備 準確稱取按真武湯復方處方準備好的藥材量的1/3（既茯苓3.00g，芍藥3.00g，生姜3.00g，白術2.00g，炮附子1.40g）至250ml錐形瓶中，精密加入一定濃度的乙醇溶液后置微波爐中提取，冷卻后補足失去的乙醇量，濾過，精確量取一定濾液（V），蒸發至近干，加甲醇溶解，轉入25ml容量瓶中，并定容至刻度，即得供試品溶液。

2.1.4 芍藥苷得率測定 取供試品溶液于230nm波長處測定吸光度值，然后帶入所得線性回歸方程中計算，即可得樣品中芍藥苷的濃度，經進一步計算就得其得率。芍藥苷得率的計算公式：得率=X×100×（25/V）×10-3/W*100%，式子中X為樣品液中芍藥苷的濃度（mg/ml），V為精確量取蒸發的液體（ml），W為真武湯藥材總質量。

2.2 單因數實驗

2.2.1 提取時間的影響 分別取按處方準備好的藥材量的1/6（既茯苓1.50g，芍藥1.50g，生姜1.50g，白術1.00g，炮附子0.70g），各六份，混勻。按料液比為1∶15加入70%的乙醇溶液，設定微波火力為中火（P=50），微波提取時間分別為1、2、3、4、5、6min，得提取液，最后測定芍藥苷的吸光度。

2.2.2 微波火力的影響 分別取按處方準備好的藥材量的1/6（既茯苓1.50g，芍藥1.50g，生姜1.50g，白術1.00g，炮附子0.70g），各五份，混勻。按料液比為1∶15加入70%的乙醇溶液，設定微波時間為3min，微波火力分別為微火（P=10）、中微火（P=30）、中火（P=50）、中高火（P=80）、最大火（P=100），得提取液，最后測定芍藥苷的吸光度。

2.2.3 料液比的影響 分別取按處方準備好的藥材量的1/6（既茯苓1.50g，芍藥1.50g，生姜1.50g，白術1.00g，炮附子0.70g），各五份，混勻。分別按料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25加入70%的乙醇溶液，設定微波火力為中火（P=50），微波提取時間為3min，得提取液，最后測定芍藥苷的吸光度。

2.2.4 乙醇濃度的影響 分別取按處方準備好的藥材量的1/6（既茯苓1.50g，芍藥1.50g，生姜1.50g，白術1.00g，炮附子0.70g），各五份，混勻。按料液比為1∶15分別加入40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，設定微波火力為中火（P=50），微波提取時間為3min，得提取液，最后測定芍藥苷的吸光度。

2.2.5 單因素實驗結果 隨著提取時間的增加芍藥苷的吸光度值先增大后減小，且在4min時有最大值；隨著微波火力的增大，芍藥苷的吸光度值先增大后減小，且在微波火力為中高火時有最大值；隨著料液比的增大，芍藥苷的吸光度值逐漸增大，后趨于平衡，其中在1∶20、1∶25時，趨于平衡；隨著乙醇濃度的增大，芍藥苷的吸光度值先增大后減小，且在濃度為70%時有最大值。

2.3 正交試驗

2.3.1 正交實驗 分別稱取按處方準備好的藥材量的1/3（既茯苓3.00g，芍藥3.00g，生姜3.00g，白術2.00g，炮附子1.40g），各9份，混勻，根據單因素實驗結果，進行L9（34）正交試驗（見表1）。

2.3.2 正交實驗的結果 由表2可知，根據K值各因素對實驗指標的影響按大小次序排列為A>D>B>C，即乙醇濃度>料液比>微波時間>火力。由方差分析F值大小可得從真武湯中提取芍藥苷的最佳條件為：A2B2C3D1，即乙醇濃度為60%，微波時間為3min，微波火力中高火，料液比為1∶10。

2.3.3 實驗驗證 取上述處方藥材三份，分別按上述最佳工藝條件A2B2C3D1，即乙醇濃度為60%，微波時間為3min，微波火力中高火，料液比為1∶10，對實驗結果進行驗證，見表3。

由表3可知，按照正交試驗所優選而得的最佳工藝進行提取試驗，三次結果芍藥苷含量均處于較高水平，這說明該最佳工藝是穩定可行的。

3 討論

真武湯為經典方劑，臨床用于心血管系統疾病、呼吸系統疾病、腎臟疾病、婦科疾病以及神經系統疾病等?，F代研究證實，該方不但具有利尿、強心的作用，還有保護受損心肌、消除自由基、提高機體應激、促進新陳代謝抗衰老等作用[1]。李景巍[2]、劉崇新[3]、荊世常[4]、何幼斌[5]等應用真武湯在臨床上取得很好療效。該方雖應用很廣，但未見該方提取工藝的研究，從而也制約該方的制劑開發。另外，微波提取技術具有快速、溶劑用量少、提取率高、成本低、質量好等許多優點，是天然產物提取中一種非常有發展潛力的新型技術[6-8]。因此本文選擇以乙醇濃度、微波時間、微波火力、料液比四個因素對真武湯中芍藥苷的提取工藝進行考察，采用單因素以及正交實驗兩者相結合，以芍藥苷為檢測指標，考察真武湯中芍藥的提取工藝。吳謙認為[9]：“真武湯尤妙在芍藥之酸收，仲景之旨微矣。蓋人之身陽根于陰，若徒以辛熱補陽，不少佐以酸收之品，恐真陽飛越矣，用芍藥者，是亟收陽氣歸根于陰也，于此推之，則可知誤服青龍致發汗亡陽者，所以于補陽藥中之必需芍藥也?！彼詸z測芍藥苷的含量具有代表性，芍藥苷含量多少與該方的有效部位的溶出度有密切關系。故本實驗用紫外分光光度法測定芍藥苷得率，方法簡單、易操作，且乙醇提取溶出的雜質少、溶劑可回收、比較經濟。實驗結果表明最佳的提取工藝為：乙醇濃度為60%，微波時間3min，微波火力中高火，料液比1∶10；且驗證實驗結果表明該最佳工藝是穩定可行的。本文通過單因素及正交試驗對真武湯的提取工藝作初步研究，以期能為開發該方新制劑奠定一定基礎。

參考文獻

[1]孟涌生.真武湯的現代研究[J].北京中醫，2007，26（9）：628-631.

[2]李景巍.真武湯加減治療老年原發性高血壓病40例[J].河南中醫，2009，29（7）：640-641.

[3]劉崇新.真武湯化裁治療上呼吸道感染后久咳138例[J].安徽中醫臨床雜志，2000，12（2）：82.

[4]荊世常.真武湯加減治療老年性遺尿95例[J].河南中醫，2011，31（1）：14.

[5]何幼斌.真武湯治療尿路結石并腎積水30例[J].湖北中醫雜志，2003，25（4）：35.

[6]張萍，廖正根，梁新麗，等.均勻設計優選舒胸片處方藥材的微波輔助提取工藝的研究 [J].中草藥，2009，40（1）：45-49.

[7]歐陽麗娜，李蘭林，吳雪，等.正交設計優選竹節參總皂苷微波提取工藝的研究[J].中草藥，2010，41（10）：1639-1642.

[8]龔盛昭，程江，楊卓如.微波場協同提取蘆丁[J].精細化工，2003，20（12）：758-760.

[9]丁曉蘭，袁媛，趙志梅.韓冰教授談真武湯之君藥[J].吉林中醫藥，2013，33（11）：1151-1152.