芍藥苷抑制大鼠小腦浦肯野細胞對急性缺氧的功能反應*

任穎鴿， 譚曉麗， 陳 靜， 張 靜， 杜永平， 張月萍△

(第四軍醫大學西京醫院 1全軍中醫內科中心， 2兒科腦發育研究室，陜西 西安 710032)

?

芍藥苷抑制大鼠小腦浦肯野細胞對急性缺氧的功能反應*

任穎鴿1,2， 譚曉麗2， 陳 靜2， 張 靜2， 杜永平1△， 張月萍2△

(第四軍醫大學西京醫院1全軍中醫內科中心，2兒科腦發育研究室，陜西 西安 710032)

目的： 研究芍藥苷(paeoniflorin，Pae)對大鼠小腦浦肯野細胞(Purkinje cells，PCs)急性缺氧電生理反應的影響。方法: 采用全細胞膜片鉗記錄法，記錄大鼠小腦PCs膜電位、興奮性和平行纖維(parallel fibre，PF)-PC興奮性突觸后電流(excitatory postsynaptic currents，EPSCs)，觀察急性缺氧和芍藥苷對上述電生理功能的影響。結果: 缺氧后PCs 首先表現為短暫的超極化，繼之以短暫的去極化和持續超極化，芍藥苷完全阻斷了PCs的缺氧性超極化，并使PCs缺氧性去極化的幅度減小，持續時間縮短；缺氧上調了PCs興奮性，芍藥苷對缺氧引起的PCs的高興奮性無顯著影響；急性缺氧引起了PF-PC EPSCs的長時程抑制(long-term depression，LTD)；芍藥苷可部分逆轉缺氧引起的PF-PC EPSCs衰減。結論: 芍藥苷顯著減輕了大鼠小腦PCs的缺氧反應，可能增強了PCs對急性缺氧的耐受性。

芍藥苷； 缺氧； 浦肯野細胞； 膜電位； 突觸傳遞

哺乳類動物中樞神經系統神經元對缺氧非常敏感，數分鐘缺氧即可改變神經元的功能，甚至導致神經元損傷或死亡。缺氧引起的神經元功能改變主要包括細胞膜去極化和突觸傳遞衰減[1-2]。近幾十年來，缺氧損傷的機制已在海馬和皮層神經元中得到廣泛的研究。然而，對缺氧高度敏感的小腦神經元卻未受到足夠的關注[3]。小腦主神經元浦肯野細胞(Purkinje cells，PCs)不僅接受來自苔狀纖維和爬行纖維(climbing fibre, CF)的興奮性輸入，而且接受來自中間神經元的抑制性輸入[4]，因而是研究缺氧損傷和缺氧保護機制的理想模型。

芍藥苷(paeoniflorin，Pae)作為芍藥的重要活性成分，有良好的神經保護作用[5]。由于芍藥苷能夠迅速透過血腦屏障，因而具有治療神經系統各種疾病的潛力。研究發現芍藥苷能夠對抗缺氧引起的興奮性氨基酸濃度升高[6]，抑制細胞內鈣超載[7]，而且能阻斷鈉離子通道[8]，激活腺苷A1受體[9]，從而發揮缺氧保護作用。然而，芍藥苷對小腦神經元的缺氧性功能反應有無影響尚不清楚。本研究采用全細胞膜片鉗技術記錄大鼠小腦PCs在急性缺氧時膜電位和突觸傳遞的變化，發現芍藥苷能顯著抑制PCs的缺氧反應，現報道如下。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 實驗動物 出生7～10 d的SD大鼠，由第四軍醫大學實驗動物中心提供。

1.2 試劑 NaCl、KC1、NaH2PO4·H2O、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、NaHCO3、葡萄糖、葡萄糖酸鉀、HEPES、EGTA、磷酸肌酸二鈉、Na2ATP、Na3GTP和KOH均購自Sigma；芍藥苷購自中國藥物檢定所。

1.3 溶液 人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)成分(mmol/L)：NaCl 126.0，KCl 5.0，NaH2PO4·H2O 1.25，MgSO4·7H2O 2.0，CaCl2·2H2O 2.0，NaHCO326.0，葡萄糖10.0，pH 7.35～7.45，滲透壓310～320 mOsm/L。電極內液成分(mmoL/L)：葡萄糖酸鉀 120.0，KC1 5.0，HEPES 10.0，EGTA 5.0，CaCl2·2H2O 0.5，MgSO4·7 H2O 2.0，磷酸肌酸二鈉 2.0，Na2ATP 4.0，Na3GTP 0.3，用濃度為0.5 mol/L的KOH調pH為7.35～7.45，滲透壓285～300 mOsm/L。

1.4 儀器 振動切片機(Leica)，正置顯微鏡(Zeiss)，微電極操縱儀(Sutter Instrument)，放大器(Axon Instrument)，模擬-數字轉換器(Axon Instruments)，電極拉制儀(Sutter Instrument)，刺激器(CYGNUS)，滲透壓測定儀(FISKE Associate)，恒流泵(上海滬西儀器廠)。

2 方法

2.1 腦片制備 取SD幼鼠小腦，放入充95% O2、5% CO2混合氣的0 ℃ ACSF中，約1 min后取出，修整后移入切片槽內固定，用振動切片機切出300 μm厚的腦片，立即轉移至32 ℃的ACSF中孵育約30 min，移至室溫下繼續孵育1 h后開始記錄。整個過程通以95% O2、5% CO2混合氣體。實驗操作及內容符合西京醫院實驗動物保護和使用委員會的規定。2.2 全細胞膜片鉗記錄 將腦片移至記錄浴槽內，先在低倍鏡下確定小腦皮層的細胞層，然后在高倍鏡下選擇表面光滑、輪廓清晰、立體感強的PCs進行全細胞膜片鉗記錄。玻璃微電極充灌內液后電阻為7～9 MΩ，電壓鉗狀態下鉗制電壓為-70 mV。記錄過程中使用恒流泵持續向記錄浴槽內灌注含95% O2、5% CO2混合氣體的ACSF，流速為2 mL/min。在保持膜電位為-60 mV左右的電流鉗狀態下，通過向細胞內注射去極化電流(-50～300 pA，300 ms)誘發記錄細胞的動作電位。將充有ACSF的玻璃微電極刺激小腦腦片的分子層，通過刺激器給予方波刺激(波寬0.1 ms，強度20～50 μA)，則可在PCs上記錄到平行纖維(parallel fibre，PF)興奮引起的興奮性突觸后電流(excitatory postsynaptic currents，EPSCs)。所有記錄在室溫(20～25 ℃)下進行。

2.3 缺氧處理和藥物干預 穩定記錄3 min后，將充以95% O2、5% CO2的ACSF轉換為充95% N2、5% CO2混合氣的ACSF灌流腦片2 min進行急性缺氧處理，2 min后再轉換為正常灌流液。進行藥物干預時，在充95% N2、5% CO2混合氣的ACSF加入芍藥苷(300 μmol/L)。研究表明芍藥苷的神經保護作用存在明顯的量效關系[5]，300 μmol/L是最佳作用劑量。

3 統計學處理

數據采集使用pCLAMP軟件，數據測量使用Clampfit軟件。數據應用Origin 8.0分析，以均數±標準差(mean±SD)表示，采用t檢驗或方差分析比較組間差異，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 芍藥苷對急性缺氧大鼠小腦PCs膜電位的影響

在電流鉗模式下，記錄PCs的膜電位。共記錄78個PCs，平均靜息膜電位為(-58.6±10.1) mV。缺氧首先使PCs表現為短暫的早期超極化，緊接著一個短暫的較大的去極化和穩定的缺氧后超極化，缺氧后超極化伴隨自發放電頻率增加，可持續30 min以上。早期超極化的時程為(0.47±0.14) min，去極化時程為(2.46±0.50) min。從缺氧處理開始到缺氧反應出現的時間延遲為0.69 min。

為了研究芍藥苷對PCs膜電位缺氧性變化的影響，在缺氧灌流液中加入芍藥苷(300 μmol/L)，結果發現PCs膜電位僅表現為短暫的去極化[ΔV=(18.8±2.8) mV，去極化時程為(1.84±0.35) min]，復氧后膜電位恢復到靜息膜電位。與單純缺氧相比，去極化時間顯著縮短(P<0.05)，去極化的幅度顯著減小(P<0.05)。早期超極化和缺氧后超極化均未出現。此外，芍藥苷使缺氧反應的延遲增加到1.2 min，與單純缺氧相比有顯著差異(P<0.05)，見圖1、表1。

Figure 1.The effects of Pae on the hypoxia-induced changes in membrane potential.

圖1 芍藥苷對缺氧引起的PCs膜電位變化的影響

表1 芍藥苷對缺氧引起的PCs膜電位變化的影響

R: resting potential; H: hypoxia hyperpolarization; D: depolarization; PH: post-hypoxia hyperpolarization.*P<0.05vshypoxia.

2 芍藥苷對急性缺氧大鼠小腦PCs興奮性的影響

電流鉗模式下，細胞被鉗制在-60 mV左右，細胞內注射去極化電流誘發PCs動作電位。結果發現缺氧使PCs動作電位的閾值由(102.8±20.5) pA 降低到(77.1±12.3) pA(P<0.01)；同時發現，缺氧后誘發動作電位的頻率增高(P<0.05)。表明缺氧上調了PCs的興奮性，見圖2。

缺氧灌流液中加入芍藥苷，仍然使PCs的動作電位閾值降低(P<0.01)，誘發動作電位的頻率增高(P<0.05)，表明芍藥苷并沒有改變缺氧引起的PCs高興奮性，見圖2。

Figure 2.The effects of Pae on the hypoxic changes of PC excitability. A: an example of a PC spikes in response to depolarizing current step (60 pA) before and after 2 min of hypoxic insult; B: pooled data of 9 PCs show that the spike frequency increased after hypoxic insult; C: the threshold of spikes was decreased significantly by hypoxic insult in rat PCs; D: an example of a PC spikes in response to depolarizing current step (60 pA) before and after hypoxia episode with Pae treatment; E: pooled data of 6 PCs show that the spike frequency increased after hypoxic insult with the presence of Pae; F: the threshold of spikes was still decreased by hypoxic insult with the presence of Pae in rat PCs. Mean±SD.n=9 in B and C;n=6 in E and F.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

圖2 芍藥苷對缺氧引起的PCs興奮性變化的影響

3 芍藥苷對急性缺氧大鼠小腦PF-PC突觸傳遞的影響

急性缺氧使大鼠小腦PF-PC突觸傳遞迅速抑制，PF-PC EPSCs的曲線下面積(area under the curve，AUC)降低到缺氧前的(43.0±4.9)%(P<0.01)并持續30 min以上，即LTD。若缺氧的同時給予芍藥苷，PF-PC EPSCs的AUC僅降低到缺氧前的(65.0±7.6)%(P<0.01)，與單純缺氧引起的EPSCs AUC相比，差異顯著(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The effects of Pae on the hypoxia-induced changes in PF-PC EPSCs. Insets are averaged PF-PC EPSCs from 6 sweeps taken before and after hypoxia. A,C: the first 10 min of the record; B,D: the last 10 min of the record.**P<0.01vsA;##P<0.01vsC;△P<0.05vsB.

圖3 芍藥苷對缺氧引起的PF-PC EPSC變化的影響

討 論

本研究發現急性缺氧引起了大鼠PCs膜電位的3相變化，首先表現為短暫的缺氧性超極化，隨后是較大的去極化，接著又是缺氧后超極化。缺氧引起的PCs膜超極化和去極化均較在其它腦區神經元觀察到的超極化或去極化的幅度大[10]。這一現象表明小腦PCs對缺氧的敏感性更高。在海馬神經元的研究顯示缺氧時由于能量代謝障礙導致ATP水平降低，激活ATP敏感的鉀離子通道引起鉀離子外流，以及腺苷釋放增多而激活腺苷A1受體，是引起缺氧性超極化的主要機制[11]。有研究發現芍藥苷能夠激活腺苷A1受體[9]，提示芍藥苷有可能通過神經元超極化而產生神經保護作用。但本實驗結果卻顯示芍藥苷阻斷了缺氧引起的PCs早期超極化和缺氧后超極化，提示在小腦主神經元PCs中，芍藥苷不是通過超極化機制發揮神經保護作用的。而芍藥苷在小腦環路的神經保護作用與腺苷A1受體激活是否相關，有待進一步研究。

缺氧性去極化被認為是神經元缺氧性損傷的觸發機制。本研究中，芍藥苷抑制了PCs缺氧性去極化的幅度和時程，并延長了PCs膜電位缺氧性反應的潛伏期，表明芍藥苷的存在增強了PCs的缺氧耐受性。有研究表明芍藥苷能對抗缺氧引起的興奮性氨基酸過度釋放[6]，阻斷鈉離子通道[8]，這可能與芍藥苷抑制了PCs缺氧性去極化有關。

關于缺氧后神經元興奮性的改變文獻報道不一致。Doolette等[12]報道缺氧后海馬CA1區神經元興奮性增高，Zhao等[13]研究發現缺氧并沒有改變CA1區神經元的興奮性。本研究發現缺氧上調了PCs的興奮性。芍藥苷雖然部分抑制了PCs的去極化，卻未改變PCs的缺氧性高興奮性。一般認為神經元缺氧狀態下興奮性增高會加速能量消耗，是導致缺氧損傷的重要機制[10]。然而，在小腦神經元環路中，如果PCs興奮性降低，PCs對小腦深部核團的傳出細胞的抑制將會減弱，小腦傳出到其它腦區的信號則會隨之增強。所以，我們認為，缺氧引起的PCs高興奮性應該是小腦環路的代償性保護機制之一，目的是有效抑制傳出細胞的興奮性輸出。以往的研究已從多方面證實芍藥苷有抑制神經元缺氧性高興奮性的作用[5-8]，因此，我們的研究結果提示芍藥苷對神經元興奮性的調節可能受不同神經元環路的影響：芍藥苷可能容易對那些釋放興奮性神經遞質神經元產生抑制，而對于釋放抑制性神經遞質的神經元的興奮性卻沒有明顯的抑制作用。芍藥苷阻斷PCs的缺氧性超極化，不影響PCs的缺氧性高興奮性，正是一種通過維持PCs興奮性，從而維持全腦抑制水平的一種神經環路保護機制。

缺氧可引起谷氨酸能突觸傳遞的迅速抑制[14]，這種抑制在多個腦區均是可逆的，甚至表現為缺氧后增強[15]。許多研究表明缺氧引起的突觸傳遞抑制與腺苷A1受體激活有關[15]。而在小腦腦片的研究顯示對腺苷不敏感的PF-PC突觸也同樣表達缺氧性抑制。本研究中，缺氧迅速引起了PF-PC LTD，與文獻報道一致，但這種抑制不因復氧而恢復，更未顯示缺氧后增強現象。雖然神經元突觸傳遞的缺氧性抑制被認為是一種保護機制，然而，PF-PC的突觸傳遞的抑制，可能導致PC-小腦深核傳出細胞的突觸傳遞的衰減，不利于小腦環路輸出信息的穩定。芍藥苷顯著抑制了PF-PC突觸傳遞的缺氧性衰減，表明芍藥苷能部分挽救缺氧后PF-PC突觸的功能狀態，有利于小腦環路輸出信息的穩定，這可能是芍藥苷發揮神經保護作用的一個重要機制。然而，芍藥苷是否對缺氧時CF-PC突觸傳遞和抑制性突觸傳遞有影響，有待我們的進一步研究。

綜上所述，缺氧可引起PCs膜電位的3相型改變，使PCs興奮性增高，迅速抑制PF-PC突觸傳遞。芍藥苷能夠完全阻斷PCs的缺氧性超極化，部分抑制PCs去極化，部分逆轉缺氧引起的PF-PC突觸傳遞衰減。我們認為芍藥苷對PCs缺氧性功能反應的抑制有利于維持小腦環路的穩定輸出，從而具有神經保護意義。

[1] Hyllienmark L, Brismar T. Effect of hypoxia on membrane potential and resting conductance in rat hippocampal neurons[J]. Neuroscience, 1999, 91(2):511-517.

[2] Zhu PJ, Krnjevic K. Anoxia selectively depresses excitatory synaptic transmission in hippocampal slices[J]. Neurosci Lett, 1994, 166(1):27-30.

[3] Barenberg P, Strahlendorf H, Strahlendorf J. Hypoxia induces an excitotoxic-type of dark cell degeneration in cerebellar Purkinje neurons[J]. Neurosci Res, 2001, 40(3):245-254.

[4] Zhang Y, Shi Z, Magnus G, et al. Functional circuitry of a unique cerebellar specialization: the valvula cerebelli of a mormyrid fish[J]. Neuroscience, 2011, 182:11-31.

[5] 朱葉芳，黨姍姍，華子瑜. 芍藥苷神經保護機制的研究進展[J]. 中國中藥雜志, 2010, 35(11):1490-1493.

[6] 孫 蓉，衣銀萍，呂麗莉，等. 芍藥苷對大鼠全腦缺血模型的影響[J]. 中國中藥雜志, 2007, 32(23):2518-2522.

[7] 楊 軍，何麗娜，何素冰，等. 芍藥甙對大鼠皮層神經細胞鈣超載損傷的保護作用[J]. 中國藥理學與毒理學雜志, 2001,15(3):164-168.

[8] Zhang GQ, Hao XM, Chen SZ, et al. Blockade of paeoniflorin on sodium current in mouse hippocampal CA1 neurons[J]. Acta Pharmacol Sin, 2003, 24(12):1248-1252.

[9] Liu H, Zhang W, Luo X, et al. Paeoniflorin attenuates neuroinflammation and dopaminergic neurodegeneration in the MPTP model of Parkinson’s disease by activation of adenosine A1 receptor[J]. Br J Pharmacol, 2006, 148(3):314-325.

[10]Fujiwara N, Higashi H, Shimoji K, et al. Effects of hypoxia on rat hippocampal neuronesinvitro[J]. J Physiol, 1987, 384:131-151.

[12]Doolette DJ, Kerr DI. Hyperexcitability in CA1 of the rat hippocampal slice following hypoxia or adenosine[J]. Brain Res, 1995, 677(1):127-137.

[13]Zhao YD, Cheng SY, Ou S, et al. Functional response of hippocampal CA1 pyramidal cells to neonatal hypoxic-ischemic brain damage[J]. Neurosci Lett, 2012, 516(1):5-8.

[14]李 晶，杜永平, 張月萍. 缺氧對谷氨酸能和GABA能突觸傳遞的影響[J]. 中國病理生理雜志，2013, 29 (2):371-375.

[15]Nieber K. Hypoxia and neuronal function underinvitroconditions[J]. Pharmacol Ther, 1999, 82(1):71-86.

Paeoniflorin inhibits functional responses of rat cerebellar Purkinje cells to acute hypoxia insult

REN Ying-ge1, 2, TAN Xiao-li2, CHEN Jing2, ZHANG Jing2, DU Yong-ping1, ZHANG Yue-ping2

(1DepartmentofTraditionalChineseMedicine,2LaboratoryofBrainDevelopment,DepartmentofPediatrics,XijingHospital,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China.E-mail:ypzhang@fmmu.edu.cn;ddyypp@fmmu.edu.cn)

AIM: To investigate the effects of paeoniflorin (Pae) on the functional responses induced by acute hypoxic insult in the rat cerebellar Purkinje cells (PCs). METHODS: The whole-cell patch clamp was used for the intracellular recording of PCs in the rat cerebellar slices to evaluate the changes of membrane potential, the excitability of PCs, and the parallel fibre (PF)-PC excitatory postsynaptic currents (EPSCs) upon acute hypoxic insult alone or with the pre-sence of Pae. RESULTS: PCs showed an initial hyperpolarization followed by brief depolarization and long lasting post-hypoxia hyperpolarization after hypoxia exposure. Pae completely blocked hypoxia-induced hyperpolarization and decreased the amplitude and the duration of hypoxic depolarization. Hypoxia up-regulated the excitability of rat PCs. Pae didn’t show any significant effect on the hypoxia-induced hyperexcitability in PCs. Acute hypoxia induced long-term depression (LTD) in rat cerebellar PF-PC EPSCs, and Pae partially reversed hypoxia-induced depression in PF-PC EPSCs. CONCLUSION: Pae significantly suppresses hypoxia-induced responses in rat PCs and probably increases the tolerance of rat PCs to acute hypoxia.

Paeoniflorin; Hypoxia; Purkinje cells; Membrane potential; Synaptic transmission

1000- 4718(2015)04- 0664- 05

2014- 12- 15

2015- 03- 12

國家自然科學基金資助項目(No. 30871029)；第四軍醫大學西京醫院助推計劃(No. XJZT10T07)

R363; R338.8

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.016

△通訊作者 張月萍 Tel: 029-84773367; E-mail: ypzhang @fmmu.edu.cn； 杜永平 Tel: 029-84771307; E-mail: ddyypp@fmmu.edu.cn