懷有先天性心臟病胎兒的孕婦與正常孕婦腸道菌群的高通量測序分析

宋勇戰， 錢明陽， 李渝芬， 鐘詩龍， 劉寶龍， 歐艷秋， 張智偉△， 曾國洪△

(1廣東省心血管病研究所， 2廣東省人民醫院，廣東省醫學科學院，廣東 廣州 510100； 3南方醫科大學研究生學院，廣東 廣州 510515)

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懷有先天性心臟病胎兒的孕婦與正常孕婦腸道菌群的高通量測序分析

宋勇戰1， 錢明陽1， 李渝芬1， 鐘詩龍2， 劉寶龍3， 歐艷秋1， 張智偉1△， 曾國洪1△

(1廣東省心血管病研究所，2廣東省人民醫院，廣東省醫學科學院，廣東 廣州 510100；3南方醫科大學研究生學院，廣東 廣州 510515)

目的： 分析懷有先天性心臟病胎兒的孕婦(PW組)與正常孕婦(NW組)的腸道菌群特征。方法: 對可能引起個體腸道菌群差異的因素加以控制，2013年6月18號～2013年12月17號收集15例正常孕婦和17例異常孕婦的糞便樣本，提取細菌基因組DNA，用PCR方法擴增16S rDNA，進行二代Illumina測序。測序數據應用運算分類單位(operational taxonomic unit，OTU)聚類分析、多樣性分析和分類學分析等生物信息技術分析2類孕婦腸道菌群的結構、多樣性和豐度。結果: 2類孕婦腸道菌群的高通量測序分析分別得到2 696 276(NW組)條和2 445 530(PW組)條優化序列，測序覆蓋深度>97%。經過97%相似度歸并后分別得到77 243個(NW組)和75 600個OTUs(PW組)；菌群多樣性分析顯示正常孕婦腸道菌群的Chao 1指數和Shannon指數均高于異常孕婦。在最佳分類水平上，正常孕婦腸道菌群由38個科的細菌構成，歸屬于14個門，以厚壁菌門(Firmicutes)為主，其次為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)等。懷有先心胎兒孕婦腸道菌群構成與正常孕婦相似，最佳分類水平上由33個科的細菌構成，歸屬于9個門，其中Firmicutes為(75.7±15.8)%，Proteobacteria為(21.1±17.0)%，Actinobacteria為(2.0±2.1)%。在最佳分類水平上，方差分析顯示兩者的雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)和紅蝽桿菌科(Coriobacteriaceae)菌種豐度有明顯差異。結論: PW組孕婦與NW組孕婦相比，整體腸道菌群含量明顯下降，提示PW組孕婦有更惡劣的腸道環境，其中部分菌群含量存在明顯差異。先天性心臟病胎兒的發生可能與孕婦惡劣的腸道微環境有關，其中Bifidobacteriaceae和Coriobacteriaceae在先天性心臟病的預防方面可能有重要作用。

腸道菌群； Illumina測序； 雙歧桿菌科； 紅蝽桿菌科； 先天性心臟病

腸道菌群被譽為是人體自身的黑匣子，一切的生命活動和代謝情況，都可以從中窺見一斑[1]。已證實腸道菌群與人體過敏反應、自身免疫病、肥胖、糖尿病、心血管疾病、自閉癥和神經系統疾病等都有明確的關系[2]。考慮到一切的外在因素最終都要通過母體影響胎兒的發育，被譽為人體另一器官、可導致機體各個系統發病的腸道菌群，可能是其中一條途徑。借助宏基因組學相關技術[3]，我們對15例正常孕婦與17例懷有先天性心臟病(congenital heart disease，CHD)胎兒孕婦的腸道菌群進行高通量測序和生物信息學分析，探討其結構組成、菌群多樣性和豐度等各方面差異，旨在為先天性心臟病的早期預防、診斷和治療探索新的路徑。

材 料 和 方 法

1 樣本的收集

2013年6月18日～2013年12月17日在廣東省人民醫院心兒科收集17例懷有先天性心臟病胎兒孕婦的糞便標本命名為PW組；在廣東省人民醫院婦產科收集15例懷有正常胎兒孕婦的糞便標本(在我院婦產科產檢未發現異常)命名為NW組。2組孕婦的基本情況見表1，孕前體重、身高和年齡經兩獨立樣本t檢驗，均沒有明顯差別(P>0.05)。所有入選孕婦要求近3個月之內未使用過抗生素。樣本質量≥5 g，放入無菌 EP 管中，做好標記，-80 ℃冰箱凍存待用。采集和運送樣本過程嚴格按照無菌操作規程進行。同時，參閱相關文獻[4]，對可能引起菌群差異的其他相關因素進行登記。懷有先天性心臟病胎兒孕婦的臨床診斷：所選標本均為有明顯畸形，胎兒多為復雜先心，見圖1；單純病變僅限大室間隔缺損(缺損>5 mm)；小房間隔缺損、小動脈導管未閉、小室間隔缺損均排除，確保在診斷方面沒有問題(17例胎兒中，大室間隔缺損3例，復雜先心病14例)。懷有正常胎兒孕婦的臨床診斷為在廣東省人民醫院婦產科產檢過程中未發現任何異常的病例。

表1 2組研究對象的一般資料

Figure 1.B-ultrasonography mode showing that the heart presences a huge atrial septal defect and a huge ventricular septal defect (A) and color Doppler ultrasound showing that the blood circulates randomly inside the heart (B).

圖1 二維切面及彩色多普勒切面顯示的胎兒復雜性先心病

2 腸道細菌宏基因組 DNA 的提取

使用細菌基因組提取試劑盒(Tiangen)制備細菌DNA，按試劑盒說明書操作。

3 16s rDNA V4可變區的擴增

所提取的DNA經過NanoDrop分光光度計檢測，所有樣品A260/A280比值均在 1.8～2.0之間。對合格的DNA樣品采用細菌16S rDNA的V4區通用引物(520F：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACA-CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACGATGC-TAYTGGGYDTAAAGNG-3’；5’-803R：CAAGCAGAA-GACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAG-ACGTGTGCTCTTCCGATCTCTACCRGGGTATCTAATC-C-3’)進行PCR擴增，擴增片段長度為 283 bp左右，引物交由廣州基迪奧生物科技有限公司合成。PCR反應體系為25 μL。

4 16S rDNA 宏基因組測序

PCR產物定量均一化后由基迪奧生物科技有限公司進行高通量測序。本次 32 個樣品，16S rDNA高變區測序所采用的測序策略為 Illumina系統的MiSeq平臺， PE250測序，V4 區域。

5 生物信息學分析

主要包括 (1) 數據過濾及拼接；(2) tags物種注釋；(3)運算分類單位(operational taxonomic unit, OTU)與物種注釋；(4) 樣品的復雜度分析；(5) 多樣品比較分析等。

6 統計學處理

應用SPSS 13.0軟件，對年齡、身高、體重、OTU數量、分類種數計量資料進行兩獨立樣本t檢驗, 使用R語言對2組(正常與先心病)樣本的菌種豐度進行方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

從短期形勢來看，在次貸危機過后，美國的經濟出現復蘇乏力的態勢，存在失業率較高的問題，同時歐盟、日本以及中國、印度等新興國家也逐漸加大對科技創新的戰略部署，因此美國政府通過創新戰略進一步強調科技創新的重要性，開啟全民創新，提供高質量就業崗位，以創新作為突破口緩解美國當時的內憂和外患[7]。

結 果

1 測序質量評價

從懷有正常胎兒的孕婦樣品中，我們共獲得2 696 276優化序列條，經過97% 相似度歸并后得到77 243 個OTUs；從懷有先天性心臟病胎兒的孕婦樣品中，我們共獲得2 445 530條優化序列。經過97% 相似度歸并后得到75 600個OTUs，測序覆蓋深度大于0.97。繪制稀釋曲線(rarefaction curve)，大部分測序樣品未進入平臺期，顯示隨著測序量的增加仍會有新的種系被發現，見圖2。

2 菌群多樣性分析

2類孕婦腸道菌群的多樣性指數如表2所示。2類樣本chao 1值和ACE值差別較大。NW組的chao 1平均值為(24 545.29±8 615.56)， ACE值為(56 171.10±28 316.01)，而PW組的 chao 1平均值為(15 707.10±4 066.74)和ACE值為(32 540.04±8 760.90)，顯示NW組孕婦腸道菌種豐度要高于PW組孕婦。

Figure 2.The rarefaction of different samples (97% similarity).

圖2 各樣品在97%相似度的稀釋曲線圖

Shannon、npShannon和Simpson這3個指數顯示兩組病人之間在菌群多樣性方面差異較小。Shannon曲線圖顯示所有樣本已進入平臺期，隨測序深度增加樣品多樣性不會有明顯變化，見圖3。

3 物種分析

克隆序列經過剪接加工整理，與16S rDNA數據庫(Ribosomal Database Project, RDP)比對，鑒定微生物菌種。基于菌門(phylum)級別分類及最佳分類水平菌科(family)級別分類，計算各樣品豐度。統計分析比較2組間菌種分布差異。

表 2 2組孕婦腸道菌群的多樣性指數

Table 2.The diversity indexes of the intestinal microbial flora from the pregnant women in the 2 groups

DiversityindexNWPWChao124545.29±8615.5615707.10±4066.74ACE56171.10±28316.0132540.04±8760.90Shannon3.91±0.523.54±0.64npShannon4.03±0.533.65±0.66Simpson0.06±0.030.10±0.07

討 論

先天性心臟病是指出生時即存在的心臟、血管結構和功能上的異常。是由于各種原因引起的正常心臟、血管組織胚胎發育異常，或是胚胎早期停止發育引起。據統計，出生缺陷已逐漸成為我國圍生期兒死亡的主要原因，而先心病占據了主要出生缺陷疾病的1/3，是最常見的心臟病。最新調查統計表明，存活新生兒中先天性心臟病的發病率為0.6%～1.0%， 國內最近調查北京市所有出生于 2007年間的新生兒，發現先天性心臟病的發病率為 0.82%，其中死產和活產嬰兒的發病率分別為 16.88%和0.67%[5]。雖然先天性心臟病的患病人數并不少，有關先天性心臟病病因的研究也有很多，但目前并沒有突破性的進展。病因方面取得共識的主要有遺傳因素、環境因素及母體方面的因素。

Figure 3.The Shannon-Wiener curves.

圖3 Shannon指數圖

Figure 4.The main components of the gut microbiota in the 2 groups.

圖4 2組孕婦腸道菌群主要成分圖

既往對先天性心臟病病因的研究，各個中心、各個地區結論不一[6-9]，且很多為環境污染等不可控因素，但各種外在因素最終是如何引起胎兒發育畸形的并沒有相關研究。鑒于腸道菌群對人體各個系統的廣泛作用，我們篩選了2組孕婦對腸道菌群與先心病的關系做一初探。

本次研究通過對17例異常孕婦和15例正常孕婦進行第2代高通量測序，共獲得2 696 276條優化序列，分別得到75 600和77 243個OTUs，兩樣本的coverage 指數均在0.97 以上，測序深度合理。菌群多樣性分析顯示NW組的chaol值、ACE均明顯高于PW組，顯示正常孕婦腸道菌群各菌種豐度要高于懷有先心胎兒的孕婦，懷有先心胎兒的孕婦整體腸道菌群含量下降，有更為惡劣的腸道微環境。2組孕婦的Shannon、npShannon及Simpson指數差別不大，顯示兩者在菌群多樣性方面差異較小。

菌群組成方面,通過與標準數據庫進行比對，門水平上，2組孕婦均以厚壁菌門、變形菌門、放線菌門組成為主，占比達到98%以上，與以往報道正常人腸道菌群組成相似[10]。顯示人體腸道菌群有很好的穩定性，懷孕并沒有引起腸道菌群的劇烈變化。最佳分類水平上，經多元方差分析發現，2組孕婦大部分菌科均無明顯差別，為人體腸道正常菌群，主要組成菌群也類似。但在雙歧桿菌科、紅蝽桿菌科兩者含量存在明顯差別，雙歧桿菌科在NW組孕婦的豐度平均值為6.91%，在PW孕婦的平均值為1.48%；紅蝽桿菌科在NW組孕婦的豐度平均值為4.76%，在PW組孕婦的豐度平均值為0.33%。NW組孕婦兩科細菌的含量要顯著高于PW組孕婦。

課題設計之初我們就考慮到個體因素可能對實驗結果的影響，借鑒既往研究的經驗[4, 11-12]，我們盡量排除了一些混雜因素可能帶來的影響。病例選擇方面，懷孕之后絕大多數媽媽都會很注意自己的飲食起居，基本上也不會使用任何藥物。我們此次篩查的病例都為南方人，來自廣東、福建、湖南 3 省的常住人口，以廣東居多，飲食習慣較為類似；家庭收入方面，絕大部分家庭人均月收入在0.5萬～1.2萬之間，考慮到孕婦在家庭中的優先權，經濟原因導致的區別基本可以排除；極個別孕婦對飲食有特殊嗜好，由于擔心對胎兒的影響，也會有所節制；入選所有孕婦均沒有不良嗜好，不抽煙、不喝酒，沒有藥物濫用史，家族沒有先心病遺傳病史，沒有高血壓、糖尿病、乙肝等常見病，均為漢族，學歷以本科、大專居多，占比達到80%。考慮到懷孕后孕婦基本以居家修養為主，孕婦的職業、戶口類型不作為影響因素。入選病例基本可以代表中國南方一名普通孕婦日常的生活狀況。基于此，基本可以認為雙歧桿菌科和紅蝽桿菌科在2組孕婦中的差別為絕對差別。

由此我們得出的結論，懷有先心胎兒的的孕婦似乎有更惡劣的腸道微環境，整體菌群的豐度較正常孕婦有所下降。對于兩者存在明顯差異的兩類細菌，搜索文章發現雙歧桿菌科、紅蝽桿菌科均為腸道益生菌，參與人體的營養代謝、免疫調節、自身保護等各個環節[13]。尤其是雙歧桿菌，它的含量和種類的變化是腸道菌群穩定與否的風向標[14]。其終生定植于人類腸道中且數量最占優勢，決定著我們的身體健康甚至壽命的長短。目前已認識到與機體的免疫功能、衰老、腫瘤甚至一些慢性病，如冠心病等密切相關。但是對雙歧桿菌的研究滯后，認識不足，也是目前學界的共識。至于孕婦腸道雙歧桿菌的變化對胎兒發育的影響，筆者搜索文章更是沒有報道。不過益生菌的顯著減少，可能就意味著無關菌群或者惡性菌群的增加，勢必會影響到孕婦很多的代謝過程，至于具體到對胎兒發育的影響，還有待后續的研究。

目前該結論的適用有一定的局限性，因為2組孕婦平均的確診時間都在28～29周左右，基本都在孕后期。一方面這是由于胎兒心血管系統發育成熟的時間所限，基本要在孕22周以后我們才能得到清晰可靠的超聲圖像；另一方面，對每一個懷疑有先心病的胎兒，我們至少要復查2次甚至多次才會確診。究竟在孕早期甚至懷孕之前是不是兩者已經有腸道菌群的差異，是不是正是由于腸道菌群的普遍減少，才會引起先心胎兒的出現，又是什么原因引起2組孕婦腸道菌群的變化，通過補充益生菌能不能預防先心胎兒的出現這些問題的解答都有待于后續的研究，但可以肯定的是我們為先心病的預防、診斷甚至治療探索到了一條新的路子。

[1] Cho I, Blaser MJ. The human microbiome: at the interface of health and disease[J]. Nat Rev Genet, 2012, 13(4):260-270.

[2] 黃秀艷, 曾耀英. 腸道微生物群的病理生理學進展[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(6):1127-1135.

[3] Floch MH. Intestinal microecology in health and wellness[J]. J Clin Gastroenterol, 2011, 45(Suppl):S108-S110.

[4] Liu S,Liu J, Tang J,et al. Environmental risk factors for congenital heart disease in the Shandong Peninsula, China: a hospital-based case-control study[J]. J Epidemiol, 2009, 19(3):122-130.

[5] Yang XY, Li XF, Lü XD, et al. Incidence of congenital heart disease in Beijing, China[J]. Chin Med J (Engl), 2009, 122(10):1128-1132.

[6] Johnson PD, Goldberg SJ, Mays MZ, et al. Threshold of trichloroethylene contamination in maternal drinking waters affecting fetal heart development in the rat[J]. Environ Health Perspect, 2003, 111(3):289-292.

[7] Ritz B, Wilhelm M. Ambient air pollution and adverse birth outcomes: methodologic issues in an emerging field[J]. Basic Clin Pharmacol Toxicol, 2008, 102(2):182-190.

[8] Hwang BF, Magnus P, Jaakkola JJ. Risk of specific birth defects in relation to chlorination and the amount of natural organic matter in the water supply[J]. Am J Epidemiol, 2002, 156(4):374-382.

[9] Malik S, Schecter A, Caughy M, et al. Effect of proximity to hazardous waste sites on the development of congenital heart disease[J]. Arch Environ Health, 2004, 59(4):177-181.

[10]Eckburg PB, Bik EM，Bernstein CN ,et al. Diversity of the human intestinal microbial flora[J]. Science, 2005, 308(5728):1635-1638.

[11]Walker A. A glut from the gut: metagenomics takes a giant step foward[J]. Nat Rev Microbiol, 2010, 8(5):315.

[12]Yatsunenko T, Rey FE, Manary MJ, et al. Human gut microbiome viewed across age and geography[J]. Nature, 2012, 486(7402):222-227.

[13]LeBlanc JG, Milani C, de Giori GS, et al. Bacteria as vitamin suppliers to their host: a gut microbiota perspective[J]. Curr Opin Biotechnol, 2013, 24(2):160-168.

[14]Matsuki T, Watanabe K, Tanaka R ,et al. Distribution of bifidobacterial species in human intestinal microflora examined with 16S rRNA-gene-targeted species-specific primers[J]. Appl Environ Microbiol, 1999, 65(10):4506-4512.

Transcriptome characterization of intestinal microbial flora in different pregnant women using Illumina sequencing

SONG Yong-zhan1, QIAN Ming-yang1, LI Yu-fen1, ZHONG Shi-long2, LIU Bao-long3, OU Yan-qiu1, ZHANG Zhi-wei1, ZENG Guo-hong1

(1GuangdongCardiovascularInstitute，2GuangdongGeneralHospital,GuangdongAcademyofMedicalScience,Guangzhou510100,China;3GraduateSchoolofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China.E-mail:yong.zhan2008@163.com;drzhangzw@sohu.com)

AIM: To investigate the characteristics of the intestinal microbial flora in the pregnant women with congenital heart disease fetus (PW group) and normal pregnant women (NW group). METHODS: Stool samples were collected from 15 NW and 17 PW cases. The bacterial genomic DNA was extracted. The 16S rDNA was amplified by PCR, and the second generation of Illumina sequencing was conducted. RESULTS: We obtained 2 696 276 (NW group) and 2 445 530 (PW group) optimized sequences. The coverage was greater than 97%. We obtained 77 243 operational taxono-mic units (OTUs) in NW group and 75 600 OTUs in PW group after a 97% similarity merge. In NW group, the Chao 1 index and the Shannon index were greater than those in PW group. The diversity analysis of microbial population indicated that they were mainly composed ofFirmicutes,ProteobacteriaandActinobacteria. In family, theBifidobacteriaceaeandCoriobacteriaceaewere significantly different through analysis of variance. CONCLUSION: TheBifidobacteriaceaeandCoriobacteriaceaemay play an important role in the occurrence of congenital heart disease.

Intestinal microbial flora; Illumina sequencing;Bifidobacteriaceae;Coriobacteriaceae; Congenital heart disease

1000- 4718(2015)04- 0702- 05

2014- 11- 10

2015- 01- 21

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.023

△通訊作者 曾國洪 Tel: 020-83827812-10810; E-mail: yong.zhan2008@163.com; 張智偉 Tel: 020-83827812-10810; E-mail: drzhangzw@sohu.com