腹腔注射四氯化碳建立大鼠肝纖維化模型

魏曉光， 郭 輝， 陳永珍， 張于娟

(1. 蘇州大學 a. 基礎醫學與生物科學學院；b. 蘇州大學 醫學部實驗中心，江蘇 蘇州 215123；2. 江南大學 無錫醫學院，江蘇 無錫 214064)

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腹腔注射四氯化碳建立大鼠肝纖維化模型

魏曉光1a， 郭 輝2， 陳永珍1a， 張于娟1b

(1. 蘇州大學 a. 基礎醫學與生物科學學院；b. 蘇州大學 醫學部實驗中心，江蘇 蘇州 215123；2. 江南大學 無錫醫學院，江蘇 無錫 214064)

腹腔注射四氯化碳(Carbon Tetrachloride, CCl4)構建大鼠肝纖維化模型，追蹤觀察模型大鼠病理組織學改變，為臨床研究提供可靠的實驗模型。模型組雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠按1.0 ml/kg劑量腹腔注射40% CCl4-橄欖油混懸液，每周3次，共計8周；對照組同時腹腔注射等量的生理鹽水。于給藥1～4、6、8周末每組隨機取6只大鼠肝臟，肉眼觀察肝臟組織大體改變，經HE和Masson染色觀察肝臟病理學改變。肝臟組織光鏡下顯示：模型組給藥第2周肝細胞發生脂肪變性；第4周肝組織局部形成假小葉，門管區有大量纖維細胞聚集；第6～8周肝組織出現大面積假小葉，建模成功率高達88.3%。采用多點、密集的腹腔注射方法可更有效地建立大鼠肝纖維化模型, 為臨床提供可靠的研究模型。

四氯化碳； 肝纖維化； 大鼠； 模型

0 引 言

肝纖維化是肝臟對各種慢性肝損傷的代償反應，是由于持續性肝損傷造成肝細胞持續壞死，導致細胞外基質、細胞群和細胞因子復雜改變，導致過多膠原在肝內沉積所致，常伴有炎癥并可發展為肝硬化[1-2]。根據肝纖維化病因建立動物模型來研究其發病機制，能為其預防和治療提供一定的實驗基礎[3]。CCl4構造肝纖維化動物模型是經典的研究方法，并最早、最廣泛地應用于實驗性肝纖維化研究。因實驗方法和條件差異缺乏統一標準，如CCl4劑量和給藥方式的不同，往往造成模型建立所需時間較長和成功率偏低[4-6]。本實驗擬采用新劑量和多點、較密集的腹腔注射CCl4方式建立大鼠肝纖維化動物模型，運用HE和Masson染色來追蹤肝纖維化發病進程，尋求一種快速、可靠、高效的肝纖維化動物模型建立方法。

1 動物模型建立

(1) 實驗動物。Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠90只，質量200～300 g，由蘇州大學動物科學研究中心提供。

(2) 動物分組及造模。選用SD雄性大鼠90只，隨機選擇30只作為對照組，余下為模型組。模型組按1.0 ml/kg 腹腔注射40% CCl4-橄欖油混懸液，每周3次，共計8周，對照組同時腹腔注射等量的生理鹽水。模型組于給藥1周末隨機取6只大鼠，對照組5只大鼠。稱量兩組大鼠體重，25%烏拉坦麻醉后取出肝臟于10%甲醛中固定，進行組織病理學檢查。模型組和對照組在2、3、4、6、8周末采取同第1周末的處理方法。

2 實驗結果

2.1 實驗大鼠一般狀態

對照組大鼠毛色有光澤，飲食飲水正常，體質量逐漸增加，生長發育狀態良好且無死亡。模型組大鼠每次給藥后情緒萎靡，煩躁不安。隨給藥時間的延長飲水減少，食欲下降，活動減少，皮毛蓬亂無光，體質重減輕。給藥3周后開始出現死亡。

2.2 肝纖維化模型成功率

83只大鼠建模成功，成功率88.3%。對照組和模型組大鼠前2周均成活。模型組第3周死亡1例，建模成功率90%；第4周1例，成功率90%；第6周2例，成功率80%；第8周3例，成功率70%；模型組大鼠的成活率是88.3%(見表1)。模型組大鼠死亡率隨給藥時間延長呈上升趨勢，實驗中死亡大鼠肛門處有大量污穢，腹部腫脹、變硬，剖腹可見腹腔嚴重腹水，肝臟腫脹，表面包裹白色薄膜，似慢性中毒死亡。

2.3 病理學改變

2.3.1 大體改變

對照組：大鼠肝臟呈紅褐色，有光澤，質地較軟，邊緣銳利，表面光滑細膩(圖1(a))。模型組：給藥第1周大鼠肝臟大體正常(圖1(b))；第2周大鼠肝臟充血呈暗紅色，表面尚光滑且有少量脂肪覆蓋(圖1(c))；第3周大鼠肝臟呈淡黃色并與膈肌粘連，質地較硬，邊緣圓鈍(圖1(d))；第4周肝臟顏色發黃，表面凹陷(圖1(e))；第6周大鼠腹腔內有少量腹水，肝臟顏色變為灰白色且與周圍組織嚴重黏連，表面皺縮并出現堅硬小結節(圖1(f))；第8周時腹腔內出現較嚴重肝腹水，肝臟表面出現大量小結節或顆粒，質地硬，切面可見肝臟正常結構被島嶼狀結節代替，結節周圍有灰白色結締組織間隔包繞(圖1(g))。

表1 實驗過程中兩組大鼠死亡情況

圖1 對照組和模型組大鼠肝臟病理學大體改變

(a)對照組，(b)模型組第1周，(c)模型組第2周，(d)模型組第3周，(e)模型組第4周，(f)模型組第6周，(g)模型組第8周

2.3.2 HE染色

肝組織HE染色光鏡顯示： 對照組肝臟肝小葉結構正常，界限清晰；中央靜脈旁有放射狀排列的肝細胞索，肝細胞體積較大，胞漿豐富；匯管區結構清晰(圖2(a))。模型組隨造模時間延長，肝纖維化程度逐漸加重，第1～2周肝小葉結構可辨，肝竇擴張淤血，中央靜脈周圍部分肝細胞出現輕度脂肪變，部分匯管區結締組織增生(圖2(b)、(c))。第3周肝索排列紊亂，肝竇狹窄，大部分肝細胞腫大，脂肪變細胞中出現大小不等球形脂滴(圖2(d))。第4周時，中央靜脈淤血明顯，肝組織病變區域多，面積大，正常肝小葉結構破壞，肝細胞索排列紊亂，中央靜脈周圍及匯管區膠原纖維與網狀纖維沉積形成纖維間隔，肝小葉結構紊亂(圖2(e))。第6～8周時，肝組織內假小葉廣泛形成并出現肝細胞不同程度的變性、壞死(圖2(f)、(g))。

圖2 對照組和模型組肝臟組織HE染色

(a)正常(400×)，(b)模型組第1周(400×)，(c)模型組第2周(400×)，(d)模型組第3周(100×)，(e)模型組第4周(100×)，(f)模型組第6周(40×)，(g)模型組第8周(40×)

2.3.3 Masson染色

肝組織Masson染色光鏡顯示：正常組肝小葉結構完整，肝細胞索排列整齊；注射CCl4第1周，近中央靜脈周圍肝細胞呈少量脂肪變性(圖3(a),(b))。第2周開始出現肝細胞脂肪變性，并有少量膠原纖維生成(圖3(c))。第3周出現大面積的肝細胞脂肪變性，膠原纖維數量增多(圖3(d))。第4周出現明顯膠原纖維沉積(圖3(e))。第6周出現膠原纖維沉積和形成明顯的假小葉(圖3(f))。第8肝臟膠原纖維逐漸增加連接成小葉間隔，形成大量的假小葉(圖3(g))。

3 討 論

目前，國內外利用CCl4建立肝纖維化模型的造模途徑有皮下注射、腹腔注射、灌胃和蒸氣吸入等方法[7-9]。皮下注射造模周期長，動物死亡率高，更重要的是操作不當會發生皮下滲漏；灌胃法造模時間長，且個體差異較大，大多數大鼠實驗結束前已死亡；蒸氣吸入法較復雜且容易引起肝外病變。經過比較，我們認為利用CCl4腹腔注射制備肝纖維化模型具有皮下注射、灌胃、蒸氣吸入造模所不可比擬的優點：快速高效、操作簡便、病理結果可靠，不易外漏。

通過查閱文獻[10-12]，預實驗遴選40% CCl4-橄欖油懸浮液以首次劑量5.0 ml/kg的劑量注射，結果大部分大鼠急性 CCl4中毒而死亡。CCl4進入體內15 min即可引起肝細胞損傷，至48 h 達到高峰，隨后進入修復階段。因此可采用間隔3～4 d 注藥1次，即在一次染毒造成肝損害后的修復期再次給藥，重復“損害—修復—損害”的過程誘導肝纖維化。本方法采用多點，較密集的1.0 ml/kg劑量注射，每周3次，共計8周。實驗選擇雄性大鼠的原因是不同性別的肝臟組織雌激素受體表達不同。研究顯示，女性肝臟雌激素受體含量是男性的3倍，這可能是造成肝纖維化性別差異的原因所在[13]。所得大鼠肝纖維化模型組織病理特點與肝纖維化病理改變相似，通過觀察CCl4誘發大鼠肝纖維化不同時段肝臟大體形態和病理組織學結果可明顯看出各模型組的區別。隨給藥時間延長肝纖維化程度增加，成功建立肝纖維化模型，符合實驗設計的預期結果。該模型既可有效形成肝纖維化且橄欖油過多沉積造成脂肪堆積，與臨床病人肝纖維化多伴有高脂飲食相接近，建模成功率高達88.3%。

圖3 對照組和模型組肝臟組織Masson三色染色(40×)

(a)正常，(b)模型組第1周，(c)模型組第2周，(d)模型組第3周，(e)模型組第4周，(f)模型組第6周，(g)模型組第8周

4 結 語

如何建立一種理想的肝纖維化動物模型，一直是實驗研究的重點和難點。一個理想的肝纖維化動物模型應該符合以下條件：①與人類肝纖維化疾病的基本病變特征相似；②病變有一定發展過程，以及病程存在可逆與不可逆的階段性演進過程；③形成率高，死亡率低，重復性好；④造模方法簡便易行和動物易獲得，經濟實用[14-16]。本實驗采用小劑量，多次重復在一次染毒造成肝損害后的修復期再次給藥的方法，縮短造模周期，降低大鼠死亡率，快速成功地建立CCl4誘導肝纖維化模型，是一個較為理想的肝纖維化動物模型。

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Studies on Rats Hepatic Fibrosis Model Established by Intraperitoneal Injection of Carbon Tetrachloride

WEIXiao-guang1a,GUOHui2,CHENYong-zhen1a,ZHANGYu-Juan1b

(1a. School of Biology and Basic Medical Sciences; 1b. Experimental Center of Medical College, Soochow University, Suzhou 215123, China; 2. Wuxi Medical School, Jiangnan University, Wuxi 214064, China)

To establish rat liver fibrosis model, CCl4solution was injected intraperitoneally and the pathological changes were observed. The result can offer fibrosis model for clinical studies. The authors use SD male rats as model group, and they were injected 40% CCl4-olive oil solution, and the control group was injected saline, intraperitoneally three times a week for 8 weeks. At the end of the 1st, 2nd, 3rd, 4th, 6th, and 8th weeks, 6 rats from each group were randomly selected to demonstrate HE and Masson staining and observe the liver pathological changes. Hepatic steatosis was observed under the microscopy after CCl4-olive oil administration for 2 weeks in model group. After 4 weeks, some pseudolobules formed and numerous fibroblasts assembled at the portal area. At six to eight weeks, numerous liver pseudolobules appeared. The rate of success modeling is up to 88.3%. Hence, multi-point and intensive intraperitoneal injection method can be more effective to rat liver fibrosis model, which is reliable for clinical research.

carbon tetrachloride (CCl4); liver fibrosis; rats; model

2015-01-30

魏曉光(1988-)，男，河南周口人，碩士生，主要研究方向為肝纖維化。Tel.: 18896500285; E-mail: wxg163361@163.com

張于娟(1979-),女，江蘇丹陽人，博士，主要方向肝細胞及胎源性疾病。

Tel.: 13771922996；E-mail: zhangyujuan@suda.edu.cn

R-331

A

1006-7167(2015)11-0034-04