開設“流式細胞術”實驗課 提高研究生實踐能力

張 英， 李 莉， 任林柱， 郝林琳， 楊 舉， 張麗穎， 黎宏宇

(吉林大學 a. 動物科學學院； b. 動物醫學學院; c. 人力資源與社會保障處, 吉林 長春 130062)

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開設“流式細胞術”實驗課 提高研究生實踐能力

張 英a， 李 莉a， 任林柱a， 郝林琳a， 楊 舉b， 張麗穎a， 黎宏宇c

(吉林大學 a. 動物科學學院； b. 動物醫學學院; c. 人力資源與社會保障處, 吉林 長春 130062)

流式細胞術是一門新興的實驗科學技術，廣泛應用于基礎研究與臨床檢測等領域。根據科研的需要，面向獸醫學相關專業的研究生開設了流式細胞術的實驗課，幫助學生深入了解了流式細胞儀的工作原理、操作方法及應用。課程中設置了“PLA2G7-EGFP質粒轉染ECA-109細胞與PK-15細胞后EGFP蛋白的表達”和“小鼠外周血單個核細胞(PBMC)的分離及B細胞的檢測”兩個教學范例。在課程中讓學生親自參與樣本的制備，包括細胞的培養與轉染、小鼠外周血的采集、單細胞懸液的制備、細胞染色、樣本過濾、流式樣本的上機操作、數據的獲取與分析等，培養了學生的動手能力及獨立操作機器的能力。并與研究生以后的科研實驗相結合，提高了學生獨立思考、分析問題、解決問題的能力，幫助研究生在未來的實驗研究中科學規劃和使用流式細胞儀。

流式細胞術； 獸醫學； 研究生； 實驗教學

0 引 言

流式細胞術(Flow Cytometry，FCM)是20世紀70年代發展起來的高科學技術，是一項對被熒光素染色的生物顆粒如各種單細胞、微生物及各種人工微球等，在激光照射高速流動狀態下，對其進行多參數、快速定量分析，以及對特定群體進行分選的現代細胞分析新技術，具有很強的實踐性和技術性。在醫學高等院校及科研機構中應用越來越普遍，隨著流式細胞術的不斷發展與完善，應用領域已從細胞生物學、發育生物學、微生物學等基礎研究擴大到腫瘤學、藥物性、血液學、臨床檢驗等各個方面[1-3]。

獸醫學院的研究生主要研究方向有生物化學與分子生物學、發育生物學、胚胎生物學、預防獸醫學、臨床獸醫學、基礎獸醫學等，根據學院的科研需求，吉林大學農學部購進一臺美國BD公司，型號為AriaⅡ的流式細胞儀，并在研究生的分子遺傳學實驗課教學課程中率先開設了流式細胞術實驗課，幫助學生了解了FCM的基本原理及應用領域，拓寬了科研思路，提高了科研實踐能力和綜合素質。

1 流式細胞儀

1.1 工作原理

流式細胞儀是一種綜合了激光技術、半導體技術、流體力學、光電測量技術等各學科的知識為一體的大型精密儀器。其主要由流動室與液流驅動系統，激光光源與光束形成系統，信號檢測、存貯、光電轉換、數據處理系統以及細胞分選系統5部分組成[4]。

將單細胞懸液樣本，經不同的熒光染料染色后置于流式管中，樣本在一定的壓力下進入流動室，在鞘液的的包裹下成單行排列，并以一定流速經過噴嘴通過激光聚焦區，在激光束的照射下，產生熒光信號和散射光信號。光信號通過波長選擇通透性濾片后，經PMT接收轉化為電信號，再經模/數轉換器，轉換為能被計算機識別的數字信號，計算機對采集的各種信號用相應的軟件進行分析處理，以一維直方圖、二維、三維散點圖或等高線圖及數據表等形式顯示出來[3]。散射光信號包括前向角散射光(Forward Scatter，FSC)及側向角散射光(Side Scatter，SSC)。FSC主要反映細胞大小，SSC主要反映細胞膜、細胞質、核膜的折射情況及細胞內顆粒的復雜程度。熒光信號的強弱反映了細胞內物質濃度或者所測細胞表面抗原的強度大小。

1.2 機型介紹

流式細胞儀根據其功能主要分為臨床分析型流式細胞儀和科研分選型流式細胞儀兩種。分析型流式細胞儀包括美國BD公司生產的FACS Calibur，FACS Count，FACS Canto II ，FACS Verse；以及美國Beckman Coulter公司生產的Epics XL，FC 500，Gallios，CyAn流式細胞儀等，只能用于流式分析，其自動化程度高，易學易掌握，主要用于臨床實驗檢測，樣本被分析后最終進入廢液桶；分選型流式細胞儀包括FACSVantage SE，FACSAria I(II/III)，Influx及MoFlo XDP等，既可用于分析又可進行分選，其功能齊全，應用靈活，能夠分選回收樣品細胞內的目標細胞，用于后續功能試驗，如PCR、FISH或繼續培養等。

2 流式細胞術的應用

在了解流式細胞儀的基礎上，介紹流式細胞術的應用。FCM既可以檢測細胞結構包括：測量細胞的大小、細胞內顆粒的復雜程度、核漿的比例、細胞表面積、DNA含量、RNA及蛋白質含量；也可以檢測細胞功能包括：細胞表面及胞漿的特異性抗原、細胞因子、細胞活性、激素結合位點、細胞受體等。隨著單克隆抗體技術、熒光化學等技術的發展，該技術作為一種快速細胞分析技術，應用領域日益擴展，越來越廣泛地應用于免疫學、獸醫微生物學、細胞學、腫瘤學及臨床實踐的各方面。包括淋巴細胞及其亞群測定、細胞凋亡及細胞周期、淋巴細胞功能檢測、細胞因子檢測、RNA測定、總蛋白測定、白血病免疫分型、HIV檢測、牛奶及化妝品中病原微生物的檢測、水質檢測等[5-6]。在講解過程中，根據本學院研究生的科研方向，利用大量的流式細胞儀分析圖譜，重點講述流式細胞術在獸醫基礎醫學、預防醫學、臨床醫學及動物干細胞研究領域的中應用，主要包括細胞因子檢測、細胞周期、細胞凋亡、淋巴細胞檢測等實驗。使學生能夠更加直觀、生動、通俗易懂地了解流式細胞術的應用。

3 實驗課程的設計

3.1 理論知識

流式細胞術實驗課課程設置20學時，理論知識講解4學時、儀器培訓4學時、流式樣品制備及上機操作12學時。目前，利用國家級動物科技實驗教學示范中心平臺，已制作完成了“流式細胞術原理、操作與技巧”視頻，結合多媒體課件，主要講述流式細胞術原理、常用概念如通道、門等，FCM數據存儲、顯示與分析、樣品的制備過程、熒光染料的選擇與使用、對照的設置、光譜重疊與補償調節及在操作過程中的具體注意事項等[7-8]。

3.2 儀器操作

FACSAria II是科研分選型流式細胞儀，較臨床機復雜。在實驗開始前，組織學生進入實驗室進行觀摩學習。結合儀器培訓時的DV視頻，重點講解流式細胞儀的結構組成及在系統中發揮的作用、儀器的開機程序及注意事項、FACS Diva Software軟件的使用方法、儀器的保養與維護、關機程序及注意事項等。并利用BD公司培訓用的熒光微球先由教師示范流式樣本的上機操作過程及如何分析實驗結果，然后學生在老師的指導下獨立練習儀器的使用方法，確保學生在實驗前對儀器有充分的了解和掌握。

3.3 流式細胞樣品分析

結合研究生的科研需要，設計兩個實驗內容：① PLA2G7-EGFP質粒轉染ECA-109細胞與PK-15細胞后EGFP蛋白的表達；② 小鼠脾臟T淋巴細胞亞類(CD3、CD4、CD8)檢測的實驗。

3.3.1 儀器、試劑與材料

生物安全柜，流式細胞儀，倒置顯微鏡，水平離心機，二氧化碳培養箱，細胞計數板，移液器(200 μL 、1 mL)，1640培養基，DMEM(Hyclone)；PLA2G7-EGFP質粒(實驗室構建)，ECA-109細胞及PK-15細胞(實驗室保存)，脂質體2000， PI(500 ug/mL)，FITC - Anti-Mouse CD19(BD公司)，動物外周血淋巴細胞分離液，昆明鼠。

3.3.2 實驗方法

實驗1：PLA2G7-EGFP質粒轉染ECA-109細胞與PK-15細胞后EGFP蛋白的表達(4學時)。

(1) 轉染細胞的準備：提前1天將ECA-109細胞及PK-15細胞用無抗生素培養液接種到12孔細胞培養板中，細胞密度達到70%左右即可進行轉染實驗。

(3) 轉染準備：細胞用1 mL無血清培養液漂洗一次，再加入300 μL無血清培養液。

(4) 轉染：取A/B混合液15 μL緩慢加到12孔板中，搖勻，37℃培養4 h后，更換10 % DMEM培養液繼續培養。

(5) 轉染24 h后，胰酶消化，收獲細胞，PBS漂洗一次，并重懸于PBS中，密度為5×105～1×106cells/mL。

(6) 流式檢測，陰性對照為未轉染質粒的ECA-109細胞及PK-15細胞。

實驗2：小鼠外周血單個核細胞(PBMC)的分離及B細胞的檢測(8學時)。

(1) 小鼠摘除眼球采血，置于肝素抗凝的1.5 mL離心管中，用等體積的PBS稀釋全血。

隨著我國城市化進程不斷加快，城市基礎設施和公共設施需求增長強勁，地方政府作為主要投資主體在很長一段時間內承擔了大量的城市建設和投資任務.很多地方政府在自身財力不夠的情況下四處舉債，承受了巨大的資金壓力和還貸風險.為了扼制這種勢頭，進入新世紀尤其是2002年以后，國家出臺了一系列的政策法規，特別是《預算法》中明文規定，不允許地方政府直接舉債和提供擔保.在這種大趨勢下，作為地方政府對外政策性投融資平臺的各類城市建設投資公司(下稱城投公司)應運而生.

(2) 在5 mL的離心管中加入一定量的淋巴細胞分離液，將稀釋后的血液加到分離液的上方，室溫，2 000～2 500 r/min離心20～30 min。

(3) 離心結束后，將血漿層與分離液層之間的較薄較致密的白膜層吸到另一個離心管中，用PBS/1640稀釋，混勻，1 000～1 500 r/min離心5～10 min，重復1到2次。

(4) 細胞計數，用100 μL PBS將淋巴細胞重懸，調整細胞濃度至2×106cells/mL。

(5) 加入10 μL FITC - Anti-Mouse CD19(0.25 mg/mL)。

(6) 4℃，避光孵育30min。

(7) 離心去上清， PBS/BSA 洗細胞2～3次，用200 μL PBS將淋巴細胞重懸，加入4 μL PI染料(500 μg/mL)，孵育5～10 min。

(8) 相同方法，分別制備空白管和各染色抗體單染對照管及實驗組樣本管。

(9) 流式上機檢測。

3.3.3 結果與分析

實驗1 PLA2G7-EGFP質粒轉染ECA-109細胞與PK-15細胞后EGFP蛋白的表達。

綠色熒光蛋白(GFP)是一種天然熒光蛋白，它在細菌、真菌、動物細胞中表達時能夠發出綠色熒光，是一種比較理想的熒光標記蛋白。增強型綠色熒光蛋白(EGFP)是在野生型GFP的基礎上對其基因進行改造，顯著提高了其在動物細胞中的熒光效能，大大增強了該報告分子的靈敏度，使EGFP非常適用于流式細胞術(FCM)分析[9-11]。為確定脂質體轉染法在不同細胞中的轉染效率，分別將含有報告基因EGFP的質粒PLA2G7-EGFP轉染ECA-109細胞與PK-15細胞。結果表明，轉染后ECA-109細胞中熒光信號強度(46.1%)明顯高于PK-15細胞(14.6%)。圖1、圖3為FSC-SSC物理參數圖，確定待檢測的細胞群；圖2、圖4為EGFP單參數直方圖(峰圖)，“P2”門為表達EGFP陽性細胞的情況。

圖1 PK-15 FSC-SSC 物理參數圖

圖2 EGFP轉PK-15 單參數直方圖

圖3 ECA-109 FSC-SSC 物理參數圖

圖4 EGFP轉ECA-109 單參數直方圖

實驗2 小鼠外周血單個核細胞(PBMC)的分離及B細胞的檢測。

小鼠血液中各種成分的比重存在差異，利用接近等滲的ficoll-hypaque混合溶液(又稱淋巴細胞分層液)作密度梯度離心時，各種血液成分將按密度梯度重新聚集。外周血單個核細胞密度略低于分層液，故位于分層液界面之上，這樣就可獲得PBMC。細胞表面抗原CD19在正常及惡性B淋巴細胞中均有表達，是B細胞發育過程中一個涵蓋階段較長的最為可靠的表面標記物。CD19+B淋巴細胞比例的變化反映機體的免疫狀態，外周血中CD19+B淋巴細胞比例的降低可能由很多原因引起，包括CD19+B淋巴細胞生成異常，破壞或丟失增加及遷徙的異常[12-15]。并利用PI染料鑒定獲得的淋巴細胞的細胞活力情況。

圖5 淋巴細胞 FSC-SSC物理參數圖

圖6 FITC / PI 雙參數散點圖

圖7 分析結果統計圖

在上述兩個實驗過程中，學生親自參與樣本的制備，包括細胞的培養與轉染、小鼠外周血的采集、單細胞懸液的制備、細胞染色、樣本過濾、流式樣本的上機操作、數據的獲取與分析等，培養了學生的動手能力及獨立操作機器的能力，讓學生更好的理解和掌握流式細胞術的原理與應用。

4 結 語

流式細胞術是一門新興的實驗科學技術,，在獸醫學院研究生實驗教學方面開設此實驗課是一個新的嘗試。通過兩年的實踐，學生反饋情況良好。既提高了大型貴重儀器的利用率，也調動了學生的學習熱情，鍛煉了學生動手操作的能力，更好地理解和掌握流式細胞術的原理與應用，實現了教學和科研的有機結合。在教學中激發了學生的探索和實踐能力，使學生真正能把這門技術運用于自己的課題研究之中。

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Setting Flow Cytometry Experiment Lesson to raise Graduates’ Practice Ability

ZHANGYinga,LILia,RENLin-zhua,HAOLin-lina,YANGJub,ZHANGLi-yinga,LIHong-yuc

(a. College of Animal Science; b. College of Veterinary Medicine; c. Human Resources and Social Security,Jilin University, Changchun 130062, China)

Flow cytometry is an emerging experimental science and technology, widely used in basic research and clinical testing and other scopes. According to research related to veterinary science-oriented graduate students, flow cytometry laboratory sessions were opened to help students understand the working principle of the flow cytometer, methods of operation and application. Two teaching courses "PLA2G7-EGFP plasmid expressing EGFP protein ECA-109 after PK-15 cells" and "detecting peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and B cells isolated" were set up. In the curriculum, students were involved in the preparation of samples, including cell culture and transfection, mouse peripheral blood collection, preparation of single cell suspensions, cell staining. The sample was filtered stream samples machine operation, acquired data and analysis. It trained the students' practical ability and the ability to operate independently of the machine. Base on these lessons, experimental research and graduate ability later was combined to improve the students in thinking independently, and enhance their analyzing problems, problem-solving skills. It also helps students to use scientific planning and study of flow cytometry experiments in the future.

Flow cytometry; veterinary; graduate; experimental teach

2014-06-09

吉林大學教學改革項目(2013326)

張 英(1979-)，女，吉林九臺人，碩士，實驗師，主要從事細胞生物學與分子生物學研究，流式細胞儀的操作與管理。

Tel.：13504429639； E-mail:zhangying636@126.com

黎宏宇(1983-),男，吉林長春人，碩士，實驗師，從事人力資源管理。Tel.:13843090842;E-mail:lihongyu@jlu.edu.cn

Q 291

A

1006-7167(2015)05-0182-04