免疫性血小板減少癥患者外周血淋巴細胞亞群變化的研究

王志強

[摘要] 目的 研究免疫性血小板減少癥（ITP）患者外周血淋巴細胞亞群的變化，探討其在疾病診斷、治療與預后方面的作用。 方法 以2012年1月～2014年1月鄂爾多斯市中心醫院血液科收治的78例ITP患者作為ITP組，同時選擇30例健康體檢者作為對照組。檢測兩組外周血淋巴細胞亞群絕對值和血小板計數，采用SPSS 13.0統計學軟件進行統計學分析。 結果 ITP組與對照組比較，CD3+ T細胞、CD3+CD4+ T細胞、CD4+/CD8+ T細胞比值、CD16+56+ NK細胞絕對值降低，CD3+CD8+ T細胞、CD19+ B細胞絕對值升高，差異有統計學意義（P<0.05）；ITP組治療后淋巴細胞亞群的變化早于血小板的變化。 結論 淋巴細胞亞群檢測對ITP的輔助診斷及治療效果的評估有較好的應用價值。

[關鍵詞] 免疫性血小板減少癥；淋巴細胞亞群；流式細胞術

[中圖分類號] R446.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2015）08（c）-0120-03

[Abstract] Objective To study the changes of peripheral blood lymphocyte subsets in patients with immune thrombocytopenia and to discuss the role in the diagnosis，treatments and prognostic. Methods 78 patients with immune thrombocytopenia reduction who were treated in the department of hematology of erdos central hospital from January 2012 to January 2014 were selected as ITP group.At the same time，30 healthy subjects were chosen as control group.The absolute value of peripheral blood lymphocyte subsets and the platelet counts between two groups was detected respectively.The statistical analysis was performed by SPSS 13.0 statistical software. Results Compared with ITP group and the control group，the number of CD3+ T cells，CD3+CD4+ T cells，CD4+/CD8+ T cells and CD16+56+ NK cells was decreased respectively，while the number of CD3+CD8+ T cells and CD19+ B cells was increased respectively，with statistical difference（P<0.05）.The changes in ITP group after treatment was earlier in lymphocyte subsets than platelet. Conclusion The detection of lymphocyte subsets has good application values for diagnosis and evaluation of the effect on the treatment to immune thrombocytopenia.

[Key words] Immune thrombocytopenia；Lymphocyte subsets；Flow cytometry

免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是以外周血血小板計數減少、骨髓巨核細胞數目正常或增多、血塊收縮不良、出血時間延長為主要特點的一種疾病。年發病率為0.25萬～0.50萬，高發年齡約為5歲[1]，一年四季均可發病，性別無明顯差異。關于ITP的病因，國內外學者大多認為其與發病前期的感染和（或）疫苗接種密切相關。Cines等[2]研究認為，ITP患兒發病前1～4周，通常有病毒感染史，如流行性腮腺炎、水痘、風疹、麻疹等。雖然誘發ITP發生的病因至今尚未明確，近年越來越多的研究表明，ITP患者除了體液免疫異常外，還存在細胞免疫的異常，尤其與T淋巴細胞亞群、細胞因子表達及功能改變有密切聯系[3]。本研究通過對免疫性血小板減少患者外周血淋巴細胞亞群的變化進行分析，探討其在疾病診斷、治療效果評估方面的臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

ITP組：選擇2012年1月～2014年1月鄂爾多斯市中心醫院血液科收治的78例免疫性血小板減少患者，其中男50例，女28例，年齡2～74歲，均為初次發病，診斷依據為張之南第3版《血液病診斷及療效標準》。對照組：選擇30例鄂爾多斯中心醫院體檢中心無任何過敏史的健康者作為對照組，其中男19例，女11例，年齡19～80歲。

1.2 儀器與試劑

淋巴細胞亞群絕對值測定用單克隆四色抗體（MultiTEST CD3/CD8/CD45/CD4，CD3/CD16+56/CD45/CD19，美國BD）；溶血素（FACS Lysing Solution，美國BD）；低速離心機（KD640，科大創新股份有限公司）；螺旋震蕩器（TW3，姜堰市新康醫療器械有限公司）；流式細胞儀（FACS Calibur，美國BD）；微量移液器（20 μl；200 μl；1000 μl，德國VITLAB）；絕對值計數管（美國BD）；5分類全自動血液分析儀（Sysmex XE5000，日本希森美康）。

1.3 標本采集

ITP組和對照組的檢測標本均在空腹狀態下無菌采集外周靜脈血，EDTA抗凝，無凝血、溶血，每管2 ml（2管），室溫存放（20～25℃），分別用作血小板計數和淋巴細胞亞群絕對值的檢測，在4 h內完成檢測。

1.4 方法

1.4.1 治療前兩組淋巴細胞亞群的檢測 診斷為ITP的78例患者治療前空腹采集2 ml EDTA抗凝靜脈血檢測淋巴細胞亞群絕對值計數。取2支淋巴細胞亞群絕對值計數專用試管，編號為1、2號。用反向加樣的方式用微量移樣器在1、2號管加入抗凝全血各50 μl，然后在1號管中加入20 μl MultiTEST CD3/CD8/CD45/CD4，2號管中加入20 μl MultiTEST CD3/CD16+56/CD45/CD19，螺旋震蕩儀上充分混勻，室溫下避光孵育15 min。然后在1、2號管各加入溶血素450 μl，充分混勻，避光裂解10 min紅細胞。最后上機檢測。對照組的淋巴細胞亞群的檢測方法同ITP組。

1.4.2 治療后ITP組血小板與淋巴細胞亞群的檢測 ITP組的78例患者治療后10 d、20 d、1個月分別采集2管EDTA抗凝靜脈血。一管用流式細胞儀檢測淋巴細胞亞群絕對值，另一管用五分類全自動血液分析儀檢測血小板計數。按照治療標準選出治療有效的患者進行研究。

1.5 統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件對數據進行分析和處理，正態分布的測得值均以均數±標準差（x±s）表示，符合正態分布的兩組間數據比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 治療前兩組淋巴細胞亞群絕對值的比較

ITP組與正常對照組之間淋巴細胞亞群絕對值比較，CD3+ T細胞、CD3+CD4+ T細胞、CD16+56+ NK細胞減少，CD4+/CD8+ T細胞比值降低、CD3+CD8+ T細胞、CD19+ B細胞增多，差異有統計學意義（P<0.05）（表1）。

2.2 治療后ITP組血小板與淋巴細胞亞群絕對值計數的比較

根據臨床診斷與療效標準，78例ITP患者1個月后治療有效的為63例。63例患者治療10 d時，血小板計數與入院時比較，差異無統計學意義（P>0.05）；淋巴細胞亞群絕對值計數中CD3+ T細胞、CD3+CD4+ T細胞、CD4+/CD8+ T細胞比值升高，CD3+CD8+ T細胞降低，與入院時比較差異有統計學意義（P<0.05）（表2）。

3 討論

ITP是一種獲得性免疫紊亂所導致的以單純性血小板減少為特征的疾病，外周血小板計數<100×109/L[4]，關于ITP的病因及發病機制至今尚未明確，但近年來隨著免疫學的發展、各種抗體的發現，更多的淋巴細胞表面標記檢測越來越方便。長期以來，國內外學者認為單核-吞噬細胞系統中體液免疫介導的血小板破壞增加、骨髓巨核細胞功能異常使血小板降低[5-8]。Roark JH等[9-12]研究表明，抗血小板抗體是通過抗原驅動誘導和體細胞突變導致有限數量的B細胞克隆增值而產生。

流式細胞術（FCM）因其具有采血量少、靈敏、快速及重復性好等特點，使國內外大量研究采用此種方式檢測免疫性血小板抗體減少并應用于臨床。隨著研究深入，發現除體液免疫外，細胞免疫在ITP的發病機制中的作用也不容忽視，一系列研究證實，B細胞產生抗血小板抗體的免疫過程需要抗原特異性CD4+ T細胞的協助，因此T細胞可能也參與了ITP疾病的發生。Kuwana等[13]通過實驗研究證實，在一些ITP患者中，T細胞在GPⅡb/Ⅲa受體碎片暴露的情況下可刺激抗體的合成，而對于天然蛋白質并不會出現此現象。BORNE等[14]研究認為，CD4+ T細胞的降低也可促進自身反應性B細胞的增值，產生血小板抗體，破壞血小板，提示ITP的發病機制可能既存在淋巴細胞表型的異常，又存在著淋巴細胞功能的異常。CD4+ T細胞具有輔助、誘導細胞及體液免疫的作用，CD8+ T細胞對細胞及體液免疫起抑制作用，因此CD4+/CD8+ T細胞比值是免疫功能狀態重要的檢測指標，李美玲等[15]認為，其比值的降低與免疫系統損傷的程度相關。在本實驗中，ITP組與對照組比較，CD4+/CD8+ T細胞比值下降，同時CD4+ T細胞絕對值數也有不同程度的降低，與研究報道較符合。研究表明NK細胞對B細胞有抑制分化的作用，還能調理抗體依賴細胞介導的細胞毒作用和吞噬作用。本實驗中ITP組較對照組NK細胞絕對值數下降，提示其對B細胞的抑制分化作用能力下降，從而使B細胞異常活化發生過強的免疫反應。在本實驗中，ITP組的淋巴細胞亞群絕對值計數與對照組比較差異有統計學意義，淋巴細胞亞群絕對值計數可以輔助診斷ITP。同時治療有效的ITP患者外周血淋巴細胞亞群中CD3+ T細胞、CD3+CD4+ T細胞、CD3+CD8+ T細胞、CD4+/CD8+ T細胞比值的改變均早于血小板計數，在臨床上對于ITP的預后判斷優于血小板計數。

綜上所述，細胞免疫與體液免疫紊亂在ITP發病中發揮重要作用，淋巴細胞亞群絕對值計數對ITP的輔助診斷和預后優于血小板計數。血小板計數和淋巴細胞亞群絕對值檢測的聯合應用對ITP的診斷及療效評估有較好的實用價值，在治療上應注意糾正免疫失衡，運用免疫調節手段治療ITP。

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（收稿日期：2015-03-12 本文編輯：王紅雙）