RCCS模擬微重力對(duì)銅綠假單胞菌毒力編碼基因和蛋白質(zhì)譜的影響

黃玉玲,徐冰心,張 軍,段育忠,楊建武,周金蓮,董滿庫,李成林,崔 彥

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失重環(huán)境感染性疾病與機(jī)體損傷的研究

·論著·

RCCS模擬微重力對(duì)銅綠假單胞菌毒力編碼基因和蛋白質(zhì)譜的影響

黃玉玲,徐冰心,張 軍,段育忠,楊建武,周金蓮,董滿庫,李成林,崔 彥

目的 探討三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(RCCS)模擬微重力環(huán)境對(duì)銅綠假單胞菌(PA)毒力編碼基因表達(dá)及菌體蛋白質(zhì)譜的影響。方法 應(yīng)用RCCS建立PA ATCC 27853模擬微重力培養(yǎng)體系，實(shí)驗(yàn)組旋轉(zhuǎn)瓶軸心與地面平行模擬微重力環(huán)境，對(duì)照組即重力組旋轉(zhuǎn)瓶軸心與地面垂直；采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)檢測(cè)cDNA樣本中毒力編碼基因外毒素(toxA)、彈性蛋白酶(lasB)、鼠李脂糖(rhlA)、綠膿菌素(phza2)mRNA的相對(duì)含量；利用表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)及CM10芯片檢測(cè)PA菌體蛋白質(zhì)譜。結(jié)果 RCCS模擬微重力處理14 d后，Real-time PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組cDNA樣本中toxA、lasB、rhlA、phza2 毒力編碼基因相對(duì)含量均低于對(duì)照組(P<0.05)；表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有82種小分子菌體蛋白質(zhì)[荷比在(2～20)×103Da范圍內(nèi)]，兩組42種菌體蛋白相對(duì)含量表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)組20種蛋白質(zhì)相對(duì)含量表達(dá)高于對(duì)照組，22種蛋白質(zhì)相對(duì)含量表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論 RCCS模擬微重力培養(yǎng)條件下PA毒力編碼基因表達(dá)和菌體蛋白質(zhì)譜發(fā)生顯著變化。

失重模擬；銅綠假單胞菌；基因表達(dá)；蛋白質(zhì)譜

隨著載人航天事業(yè)的迅猛發(fā)展，太空感染問題亟待深入研究。研究表明，微重力環(huán)境不僅導(dǎo)致細(xì)菌生物學(xué)性狀改變，而且能夠改變機(jī)體各部位的菌群構(gòu)成[1-2]。同時(shí)，微重力作為一種特殊的應(yīng)激原，能夠抑制機(jī)體的非特異性免疫系統(tǒng)[3]。隨宇航員和飛行器進(jìn)入太空的微生物時(shí)刻威脅著宇航員的健康及飛行器的安全[4]。銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginos， PA)是一種常見的條件性致病菌，易引起免疫功能低下人群急性感染，并容易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致實(shí)質(zhì)性組織損傷、系統(tǒng)性蔓延、敗血癥甚至死亡[5]。阿波羅13號(hào)宇宙飛船執(zhí)行任務(wù)途中，曾有宇航員發(fā)生PA引起的泌尿系統(tǒng)感染[6]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，模擬微重力環(huán)境下經(jīng)口腔灌注PA的大鼠死亡率顯著增加，死亡時(shí)間明顯縮短，皮質(zhì)醇水平上升，且器官清除細(xì)菌能力顯著降低[7]。本文使用三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(RCCS)建立PA模擬微重力培養(yǎng)體系，研究模擬微重力環(huán)境對(duì)PA菌毒力編碼基因表達(dá)和菌體蛋白質(zhì)譜的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種：PA ATCC 27853標(biāo)準(zhǔn)菌株(中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心)。

1.1.2 主要試劑：LB培養(yǎng)基，MH肉湯培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；Trizol提取試劑盒(上海生工技術(shù)服務(wù)有限公司)；第一鏈cDNA合成試劑盒(上海生工技術(shù)服務(wù)有限公司)；Sybr Green PCR Master Mix(美國(guó)Applied Biosystem公司)；管家基因(16S)、toxA、lasB、phzA2、rhlA引物(上海生工技術(shù)服務(wù)有限公司)；CM10芯片(美國(guó)Ciphergen公司)。

1.1.3 主要儀器：RCCS(美國(guó)Synthecon公司)；PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀(美國(guó)Applied Biosystem公司)；DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(上海琪特分析儀器有限公司)；StepOne型熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystem公司)；超聲波細(xì)胞粉碎儀JY 92-2(上海新諾儀器設(shè)備有限公司)；蛋白芯片質(zhì)譜儀PBSⅡ-C(美國(guó)Ciphergen公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及模擬微重力細(xì)菌培養(yǎng)：參照文獻(xiàn)[8]，PA增菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，調(diào)整菌液終濃度為103cfu/ml；浸洗細(xì)胞培養(yǎng)瓶10 min，棄廢液，加注菌液，排空氣泡，安置培養(yǎng)瓶于RCCS上。實(shí)驗(yàn)組(模擬微重力組)培養(yǎng)瓶軸心與地面平行，對(duì)照組(地面重力組)培養(yǎng)瓶軸心與地面垂直，25 r/min、37℃恒溫條件下持續(xù)培養(yǎng)PA，每24 h更換培養(yǎng)基，收集培養(yǎng)14 d后實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的PA菌體。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)法檢測(cè)毒力編碼基因外毒素A(toxA)、彈性蛋白酶(lasB)、鼠李脂糖(rhlA)和綠膿菌素(phza2)mRNA表達(dá)：①引物設(shè)計(jì)：引物序列引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，見表1。②總DNA提取：取1 ml菌液離心，棄上清；加1 ml 1×TE吹打混勻，離心至8000 r/min，棄上清；重復(fù)步驟2后，加入溶菌酶和溶葡球菌酶各100 μl，震蕩混勻，37℃水浴1 h。Trizol法提取細(xì)菌總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)提取總RNA，BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)照相。③反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈：采用第1鏈cDNA合成試劑盒，將提取的總RNA經(jīng)二步法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。④Real-time PCR法檢測(cè)：Real-time PCR反應(yīng)體系由SybrGreen PCR Master(2X)、forward primer、reversed primer、ddH2O和cDNA template組成。擴(kuò)增反應(yīng)在ABI Stepone plus型熒光定量PCR儀上進(jìn)行，基因擴(kuò)增條件：2 min 95℃(Hold)，10 s 95℃(Melt)，40 s 60℃(Anneal/Extend)，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，聯(lián)機(jī)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 PCR引物及擴(kuò)增產(chǎn)物

注：toxA為外毒素A，lasB為彈性蛋白酶，rhlA為鼠李脂糖，phza2為綠膿菌素

1.2.3 表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)菌體蛋白質(zhì)譜： ①提取蛋白： 收集實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組菌體，4℃預(yù)冷低鹽PBS洗2次，加入1 ml裂解液，細(xì)胞破碎儀震蕩10 s，冰浴20 s，震蕩10 s，如此反復(fù)至累計(jì)震蕩時(shí)間10 min。4℃離心，12 000 r/min，收集上清，即為菌體蛋白溶液。Bradford法定量蛋白，-80℃保存?zhèn)溆谩＂跇?biāo)本處理：取出樣品凍融，以10 000 r/min，4℃，離心2 min；每個(gè)芯片點(diǎn)需要樣品10 μl，將樣品用2倍體積U9緩沖液稀釋，冰浴震蕩30 min；將30 μl上述樣品與370 μl NaAc迅速混勻。③樣品檢測(cè)：CM10 型芯片安裝于加樣器上，在芯片處理器每孔中加入上述處理好的樣品100 μl，置振蕩器300 r/min，室溫震蕩孵育1 h。甩去樣品，結(jié)合緩沖液洗2次。每孔加入HEPES(1 mmol/L，pH=4.0)200 μl，取出芯片，待干后，加SPA 0.5 μl 2次。自然干燥后，蛋白芯片閱讀機(jī)進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析。④數(shù)據(jù)采集：將CM10芯片放入蛋白芯片質(zhì)譜儀內(nèi)讀取菌體蛋白信息，用Ciphergen Protein Chip Software 3.2.0 軟件自動(dòng)收集數(shù)據(jù)，設(shè)定采集條件，最高檢測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量200×103，優(yōu)化Mr范圍2×103～20×103，計(jì)算機(jī)根據(jù)采集的數(shù)據(jù)繪制出蛋白質(zhì)譜圖。儀器每日用Ciphergen公司的ALL-INONE標(biāo)準(zhǔn)蛋白校正，控制系統(tǒng)質(zhì)量偏差在0.1%內(nèi)。

2 結(jié)果

2.1 Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 RNA樣品純度：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組總RNA凝膠電泳可見清晰的16 S和23 S兩條帶，在近加樣孔處未見DNA條帶。表明所提取RNA不存在基因組DNA污染，未被RNA酶降解。

2.1.2 Real-time PCR溶解和擴(kuò)增結(jié)果： 兩組toxA、lasB、rhlA、phza2基因Ct值均在18～30，與模板濃度具有良好的線性關(guān)系。熔解曲線顯示，4個(gè)基因均只有一個(gè)特異峰，且峰形較銳利，提示擴(kuò)增反應(yīng)特異性良好，見圖1(phza2為例)。擴(kuò)增曲線顯示，曲線拐點(diǎn)清楚，基線平而無上揚(yáng)現(xiàn)象，各管擴(kuò)增曲線平行性良好，各反應(yīng)管擴(kuò)增效率相近，見圖2(phza2為例)。

2.1.3 Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果： 采用2-△△Ct法對(duì)Real-time PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，經(jīng)RCCS模擬微重力處理后實(shí)驗(yàn)組lasB、phza2、rhlA、toxA mRNA表達(dá)水平分別為0.159±0.005、0.215±0.036、0.203±0.005、0.141±0.019，對(duì)照組分別為1.003±0.096、1.005±0.128、1.000±0.020、1.011±0.184。實(shí)驗(yàn)組低于對(duì)照組(P<0.05)，見圖3。

2.2 菌體蛋白質(zhì)圖譜分析 PA菌體蛋白質(zhì)圖譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，菌體蛋白質(zhì)荷比(M/Z)在(2～20)×103Da范圍內(nèi)共檢出82個(gè)蛋白質(zhì)峰，經(jīng)實(shí)驗(yàn)14 d后，兩組82個(gè)菌體蛋白質(zhì)中有42個(gè)蛋白質(zhì)相對(duì)含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中20個(gè)蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)組相對(duì)含量表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)，見表2；22個(gè)蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)組相對(duì)含量表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.05)，見表3；蛋白質(zhì)表達(dá)峰形圖見圖4。

圖1 綠膿菌素基因?qū)崟r(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)熔解曲線

圖2 綠膿菌素基因?qū)崟r(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增曲線

實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)瓶軸心與地面平行，模擬微重力；對(duì)照組培養(yǎng)瓶軸心與地面垂直

圖3 兩組毒力編碼基因表達(dá)水平比較

實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)瓶軸心與地面平行，模擬微重力；對(duì)照組培養(yǎng)瓶軸心與地面垂直；與對(duì)照組比較，aP<0.05

表2 兩組20個(gè)蛋白質(zhì)相對(duì)含量比較

注：實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)瓶軸心與地面平行，模擬微重力；對(duì)照組培養(yǎng)瓶軸心與地面垂直；與對(duì)照組比較，aP<0.05

表3 兩組22個(gè)蛋白質(zhì)相對(duì)含量的比較

注：實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)瓶軸心與地面平行，模擬微重力；對(duì)照組培養(yǎng)瓶軸心與地面垂直；與對(duì)照組比較，aP<0.05

圖4 兩組蛋白質(zhì)表達(dá)峰形圖

A.箭頭所指為實(shí)驗(yàn)組質(zhì)荷比為6973 Da的蛋白質(zhì)表達(dá)；B.箭頭所指為實(shí)驗(yàn)組質(zhì)荷比為7581 Da的蛋白質(zhì)表達(dá)；實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)瓶軸心與地面平行，模擬微重力；對(duì)照組培養(yǎng)瓶軸心與地面垂直

3 討論

PA在免疫功能低下及其他特殊情況下易導(dǎo)致急性或慢性感染，往往癥狀嚴(yán)重，預(yù)防及治療十分困難[9-10]。Crabbé等[11-12]進(jìn)行模擬微重力培養(yǎng)24 h和飛船搭載培養(yǎng)25 h研究發(fā)現(xiàn)，短期微重力培養(yǎng)后PA藻酸鹽、LasB、rhlA產(chǎn)生增加，其中PA PAO1菌株涉及的多種應(yīng)激反應(yīng)蛋白合成、致病因子表達(dá)以及各種生理代謝物質(zhì)合成等基因表達(dá)上調(diào)，致病性增強(qiáng)。Kim等[13]研究航天搭載連續(xù)培養(yǎng)72 h的PA PA14菌株，寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)條件下比對(duì)照組菌株的細(xì)菌濃度更高。另有研究表明，模擬微重力處理后PA PAUG2菌株的生長(zhǎng)曲線和膜極化值與對(duì)照組比較無顯著差異[14]，PA PA103菌株的生長(zhǎng)周期及外毒素產(chǎn)量也無顯著差異[15]。

toxA、lasB、rhlA和phza2為PA的毒力編碼基因[10-12]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)RCCS模擬微重力處理14 d后，toxA、lasB、rhlA、phza2 mRNA的表達(dá)水平均較對(duì)照組降低，顯示PA的致病力減低。這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果不盡一致。本研究中RCCS模擬微重力時(shí)間為14 d，分析認(rèn)為隨微重力暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，PA對(duì)微重力環(huán)境可產(chǎn)生適應(yīng)，多種應(yīng)激反應(yīng)蛋白、致病因子、各種生理代謝物質(zhì)的表達(dá)合成會(huì)發(fā)生一系列變化，進(jìn)而引起PA毒力因子表達(dá)下調(diào)。另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異還可能與微重力具體環(huán)境和培養(yǎng)條件不同有關(guān)，但具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

蛋白芯片質(zhì)譜技術(shù)是將芯片概念與質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合發(fā)展起來的一門新興技術(shù)，具有能直接檢測(cè)、特異性強(qiáng)、靈敏度高及自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，能夠檢測(cè)低豐度、相對(duì)分子質(zhì)量低的蛋白質(zhì)，主要適用于相對(duì)分子質(zhì)量在(2～20)×103Da范圍內(nèi)的小分子蛋白質(zhì)或多肽的篩選研究，該技術(shù)已用于航天醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究[16-17]。CM10是一種WCX芯片，能與表面帶正電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，如賴氨酸、精氨酸或組氨酸，可以用來檢測(cè)未知的表面帶有正電荷蛋白質(zhì)或多肽，多用于高等電點(diǎn)蛋白質(zhì)的選擇性分析和生物標(biāo)記分子的檢測(cè)，適用于PA菌體蛋白的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[18]。Crabbé等[11,19]研究發(fā)現(xiàn)，在模擬微重力環(huán)境下培養(yǎng)24 h，PA毒力蛋白lasB、rhlA及藻酸鹽產(chǎn)量增加，但phza2的產(chǎn)量無明顯變化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在模擬微重力環(huán)境下生物被膜的形成受剪切力的影響，在低剪切力作用下PA PAO1菌株形成黏稠的細(xì)胞聚集物，而在高剪切力作用下可形成穩(wěn)固的生物被膜。另有研究發(fā)現(xiàn)，模擬微重力環(huán)境下PA可形成穩(wěn)固的生物被膜，在劇烈振動(dòng)條件下仍能穩(wěn)固存在[20]。Kim等[21]研究證實(shí)，經(jīng)亞特蘭蒂斯號(hào)航天飛機(jī)太空搭載連續(xù)培養(yǎng)72 h后，PA生物膜數(shù)量增多、厚度增厚、生物膜上活細(xì)胞增多，且生物膜結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)RCCS模擬微重力培養(yǎng)14 d后，CM10蛋白芯片檢測(cè)出82個(gè)PA菌體小分子蛋白，其中42個(gè)蛋白質(zhì)兩組表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中20個(gè)蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)組相對(duì)含量表達(dá)高于對(duì)照組，22個(gè)蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)組相對(duì)含量表達(dá)低于對(duì)照組，這說明微重力環(huán)境能夠影響菌體代謝狀態(tài)，刺激或抑制部分菌體蛋白合成及分解。分析認(rèn)為，這些表達(dá)差異的蛋白質(zhì)在失重應(yīng)激與應(yīng)激耐受或適應(yīng)過程中可能發(fā)揮重要作用，包括影響PA生物被膜生成、多種毒力因子產(chǎn)生及宿主免疫防御系統(tǒng)能力受損等。

綜上所述，隨著空間探索事業(yè)的迅猛發(fā)展，研究太空感染問題、制定合理的防治措施已刻不容緩。據(jù)統(tǒng)計(jì)，曾執(zhí)行過航天任務(wù)的742名宇航員中，共發(fā)生過29種感染性疾病，包括真菌感染、流感樣疾病、尿路感染、病毒性腸胃炎和皮膚感染等，PA可隨宇航員進(jìn)入太空環(huán)境，是主要病原菌之一[22]。我們研究發(fā)現(xiàn)，RCCS模擬微重力條件下PA的生物學(xué)性狀受到影響，毒力編碼基因和蛋白質(zhì)譜發(fā)生變化，具體機(jī)制尚待深入研究。

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Effects of Simulated Microgravity with RCCS on the Expression of Virulence Encoding Genes and Proteinic Profiles of Pseudomonas Aeruginosa Mycoprotein

HUANG Yu-ling1, XU Bing-xin2a, ZHANG Jun2a, DUAN Yu-zhong2b, YANG Jian-wu2b, ZHOU Jin-lian2c, DONG Man-ku2b, LI Cheng-lin2b, CUI Yan2b

(1. Department of General Surgery, the People's Hospital of Daxing District, Beijing 102600, China; a. Department of Special Medical Laboratory Center, b. Department of General Surgery, c. Department of Pathology, 2. 306 Hospital of PLA, Beijing 100101, China)

Objective To investigate the effects of simulated microgravity with the rotary cell culture system (RCCS) on the expression of virulence encoding genes and proteinic profiles of Pseudomonas aeruginosa (PA) mycoprotein. Methods The cultured system of PA ATCC 27853 under simulated microgravity were established using RCCS, and the control group was oriented to achieving normal earth gravity, while experiment group simulated microgravity. The relative contents of toxA, lasB, rhlA and phza2 mRNA virulence encoding genes in cDNA samples were detected by real-time PCR (polymerase chain reaction) method. The PA tropina profiles were detected using the surface-enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry and CM10 chip. Results After being cultured for 14 d, the relative contents of toxA, lasB, rhlA and phza2 mRNA virulence encoding genes in cDNA samples were significantly lower than those in control group by real-time PCR detection (P<0.05); 82 types of micromolecule tropina from 2×103to 20×103dalton range were discovered by surface-enhanced laser desorption-ionization time-mass spectrometry (SELDI-TOF-MS) method in control and experiment groups; the differences of 42 types of micromolecule tropina expressions of relative contents in the two groups were statistically significant, and 20 types expressions of relative contents in the experiment group were higher than those in control group, and 22 types' expression of relative contents were lower than those in the control group (P<0.05). Conclusion The expression of virulence encoding genes and proteinic profiles of PA mycoprotein can be effectively affected after being cultured by RCCS simulated microgravity.

Weightlessness simulation； Pseudomonas aeruginosa； Gene expression； Proteinic profiles

全軍醫(yī)學(xué)科研“十二五”重點(diǎn)項(xiàng)目(BWS11J051)

102600 北京，北京市大興區(qū)人民醫(yī)院普通外科(黃玉玲)；100101 北京，解放軍306醫(yī)院特種醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心(徐冰心、張軍)，普通外科(段育忠、楊建武、董滿庫、李成林、崔彥)，病理科(周金蓮)

崔彥，E-mail：dryancui@aliyun.com；董滿庫，E-mail：dongmanku1126@sina.com

R378.991；R856

A

2095-140X(2015)06-0001-05

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.06.001

2015-02-27 修回時(shí)間：2015-03-20)