阿托伐他汀對模擬失重大鼠肺炎鏈球菌感染的保護作用

朱敏立,王小輝,王 萍,李月越,崔 彥

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·論著·

阿托伐他汀對模擬失重大鼠肺炎鏈球菌感染的保護作用

朱敏立,王小輝,王 萍,李月越,崔 彥

目的 研究模擬失重狀態下阿托伐他汀對上呼吸道定植菌肺炎鏈球菌導致肺部感染的影響，為航天員呼吸系統保護及感染治療提供理論依據。方法 將Wistar大鼠40只隨機分為4組(n=10)，分別為失重感染組(weightlessness+infection， WI)、失重感染他汀組(weightlessness+infection+statin， WIS)、對照感染組(control+infection， CI)及對照感染他汀組(control+infection+statin， CIS)。WI和WIS組采用大鼠尾吊法模擬失重狀態，CI和CIS組在鼠籠內自由活動，于第3天經氣管滴入肺炎鏈球菌懸液0.4 ml，復制大鼠肺部感染模型。從實驗第1天開始他汀組(WIS組、CIS組)給予阿托伐他汀10 mg/(kg·d)藥物灌胃，無藥物干預組(WI組、CI組)給予等量無菌注射用水灌胃。尾吊8 d后處死動物取材，測血常規、中性粒細胞黏附分子(CD11b/c)，肺組織切片觀察肺組織病理變化。結果 肉眼觀察4組大鼠肺組織表面出現不同程度的局部充血及點片狀出血；光鏡下可見肺泡腔內大量以中性粒細胞為主的炎性細胞浸潤，部分肺泡結構消失。上述改變以WI組表現最重，CIS組表現最輕，其中失重大鼠以上葉表現更為突出。各組間白細胞、中性粒細胞值差異有統計學意義(F=3.67，P<0.05；F=7.47，P<0.01)，WI組數值最高，CIS組最低。各組間血中性粒細胞CD11b/c比較差異有統計學意義(P<0.01)，其中WI組大鼠的CD11b/c值最高(167.75±28.39)，CIS組CD11b/c值最低(115.57±18.57)。各組間NEU百分比(NEU%)差異無統計學意義(P>0.05)。結論 模擬失重狀態下肺炎鏈球菌所致肺部感染炎性反應更強，病理損害更重，阿托伐他汀對肺組織具有保護作用。

失重模擬；大鼠, Wistar；阿托伐他汀；肺炎鏈球菌

在太空環境中，重力和輻射的變化對機體多系統產生影響，呼吸系統是受失重或微重力影響較為明顯的系統之一。肺除了參與氣體交換，同時具有一定的免疫防御及免疫調節功能，失重時體液頭向分布，導致肺血容量增加，造成“肺淤血”，不僅導致肺功能受損，同時其免疫調節及抗感染能力下降[1-2]。由于肺直接與外界相通，在上呼吸道有多種細菌定植，當免疫力低下時有可能進入下呼吸道繁殖，從而產生炎性反應。本研究觀察失重對常見上呼吸道定植菌肺炎鏈球菌導致肺部感染的影響，同時研究該特殊環境下阿托伐他汀的作用，為航天員呼吸系統的保護及其疾病的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與動物分組

1.1.1 主要儀器:FACS Calibur型流式細胞儀(美國BD公司)，KX-21全自動血液分析儀(日本希森美康公司)，臺式高速離心機(無錫市瑞江分析儀器有限公司)，簡易細菌濃度測定儀(法國Biomerieux公司)。

1.1.2 主要試劑: 標準肺炎鏈球菌菌株ATCC6303購自上海市米寶萊科技有限公司，按說明書配置成所需濃度待用。干預藥物他汀類為輝瑞制藥公司產品阿托伐他汀。大鼠中性粒細胞分離液試劑盒購自天津灝洋生物制品科技有限責任公司，Anti-Rat CD11b/c PE、Anti-Rat Granulocyte Marker FITC為美國eBioscience公司產品。

1.1.3 實驗動物及分組： 健康清潔級雄性Wistar大鼠40只(北京華阜康生物科技股份有限公司)，體重(280±20)g，采用隨機數字表法隨機分為4組，每組各為10只，分別為失重感染組(weightlessness+infection， WI)、失重感染他汀組(weightlessness+infection+statin， WIS)、對照感染組(control+infection， CI)及對照感染他汀組(control+infection+statin， CIS)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立： 動物實驗經醫院倫理委員會批準后進行。采用陳杰等[3]研究方法建立模擬失重動物模型：將失重大鼠(WI組和WIS組)大鼠尾部固定于籠頂，使大鼠后肢恰好離地，保持身體與地面的傾斜度為30°，懸吊8 d，CI組和CIS組大鼠于鼠籠中自由活動。4組大鼠于尾懸吊(或鼠籠自由活動)第3天經氣管內滴入9×108cfu/ml的肺炎鏈球菌懸液0.4 ml，制作肺炎鏈球菌感染模型。從實驗第1天開始他汀干預組(WIS組和CIS組)采用阿托伐他汀按照10 mg/kg溶于1 ml生理鹽水后灌胃，每天1次，連續8 d。無他汀干預組(WI組和CI組)于同一時間以等量無菌生理鹽水灌胃。

1.2.2 標本采集及檢測： 于大鼠尾吊(或地面自由活動)第8天，以2%戊巴比妥鈉60 mg/kg行腹腔麻醉后，經腹主動脈取血，檢測血常規及中性粒細胞黏附分子(CD11b/c)表達水平，放血處死后取大鼠右肺上葉組織經4%多聚甲醛固定，行HE染色觀察病理變化。取右側支氣管肺泡灌洗液送檢微生物培養。參照大鼠中性粒細胞分離液說明書分離中性粒細胞，1 ml PBS溶液配成中性粒細胞懸液后，加入1 μl Anti-Rat Granulocyte Marker FITC和5 μl Anti-Rat CD11b/c PE充分混勻，室溫避光20 min，流式細胞儀檢測CD11b/c表達水平。

2 結果

2.1 一般情況 經氣管注入細菌后第2天開始，部分大鼠出現精神萎靡，進食減少，呼吸困難，4只大鼠在實驗結束前死亡，其中WI組2只，WIS組及CI組各1只。從肺泡灌洗液中均培養出所注入的肺炎鏈球菌，證明肺炎由所注入的細菌所致。

2.2 大鼠肺組織病理變化 4組大鼠肺組織大體標本肉眼觀察可見肺組織表面不同程度地出現局部充血，部分肺組織表面凹凸不平，局部可見點片狀出血；光鏡下可見肺內小靜脈及毛細血管充盈擴張，肺泡間隔增寬，肺泡腔內大量以中性粒細胞為主的炎性細胞浸潤，部分肺泡結構消失。上述表現以WI組表現最重，CIS組表現最輕，同時失重大鼠(WI組及WIS組)局部肺組織表面充血和片狀出血以上葉表現更為突出，見圖1。

圖1 光鏡下4組大鼠肺組織病理學形態(HE×100)

A.對照感染組：肺泡大小不均，間隔增厚，中性粒細胞浸潤；B.對照組感染他汀組：病理改變較對照感染組改善；C.失重感染組：肺泡結構基本消失，間隔明顯增厚，中性粒細胞浸潤；D.失重感染他汀組：病理改變較失重感染組減輕

2.3 血常規指標比較 對4組大鼠數據進行單因素方差分析，多組間比較結果顯示，各組間白細胞、中性粒細胞值比較差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)，均以WI組數值最高，CIS組最低。但各組間中性粒細胞百分比(NEU%)比較差異無統計意義(P>0.05)。兩兩組間比較顯示，WI組大鼠的白細胞和中性粒細胞值均高于WIS組和CI組(P<0.05)；與CI組大鼠比較，CIS組大鼠中性粒細胞值降低(P<0.05)，CIS組白細胞值雖然低于CI組大鼠，但差異無統計學意義(P>0.05)，CIS組白細胞、中性粒細胞值與WIS組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 4組大鼠血常規指標的比較±s)

注：失重感染組建立失重動物模型，給予無菌生理鹽水灌胃；失重感染他汀組建立失重動物模型，給予阿托伐他汀灌胃；對照感染組于鼠籠自由活動，給予無菌生理鹽水灌胃；對照感染他汀組于鼠籠自由活動，給予阿托伐他汀灌胃

2.4 中性粒細胞CD11b/c表達水平 WI、WIS、CI、CIS組大鼠中性粒細胞CD11b/c表達水平分別為(167.75±28.39)、(139.48±25.77)、(140.20±30.14)、(115.57±18.57)。對4組大鼠數據進行單因素方差分析，結果顯示4組間大鼠中性粒細胞CD11b/c表達水平比較差異有統計學意義(P<0.01)，兩組間比較，結果顯示：WI組大鼠中性粒細胞CD11b/c表達水平高于WIS組和CI組(P<0.05)，CIS組低于CI組(P<0.05)，CIS組和WIS組大鼠間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討論

隨著國內外載人航天事業的飛速發展，宇航員須在脫離地球重力環境下生存和完成各種任務。失重狀態下，航天員機體各器官系統將發生改變，其中肺組織是對重力改變較為敏感而容易受到損害的器官之一[4-6]。我們此前的研究證實，模擬失重狀態下機體原有內環境穩態被打破，免疫系統功能異常，機體抗感染能力下降，炎性反應增強，與國內外其他學者研究發現基本一致，同時在肺損傷過程中多數細胞因子發生變化，如TNF-α及IL-6等[6-7]。

隨著太空技術的發展，將有越來越多的航天員甚至普通大眾進入太空，這種特殊環境對人體的影響也逐漸成為熱點。研究顯示太空飛行導致小鼠的脾臟及胸腺重量減低，胸腺中T淋巴細胞相關基因表達發生改變，從而影響機體免疫功能[8]。同時，模擬微重力或失重可導致機體氧化應激反應發生改變，Qu等[9]采用回旋器模擬微重力環境，顯示人類神經細胞出現一系列氧化應激-適應-氧化損傷的變化。Cui等[10]實驗從另一角度證實模擬失重可導致大鼠肝臟的應激反應。這種在免疫及氧化應激系統發生變化的情況下，機體容易被致病微生物入侵。

上呼吸道中通常有條件致病菌定植，如溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌等，一旦體內外環境發生變化時，這些細菌可下行導致肺部感染。中性粒細胞是機體防御感染的關鍵細胞。當呼吸系統感染時，中性粒細胞進入肺組織來清除致病原，但其同時也釋放炎性遞質，造成肺組織損傷[11]。CD11b/c為一種整合素，是中性粒細胞重要黏附分子之一，主要儲存在胞質內，當炎性刺激(尤其是細菌毒素)時，CD11b表達上調并轉移到細胞膜表面，介導其與血管內皮細胞黏附，到達炎癥部位，釋放有害物質，致組織損害[12]。因此，一般狀況下CD11b表達水平越高提示肺組織受損越重。本研究結果證實，失重組大鼠肺部感染后，CD11b/c表達高于地面對照組肺感染大鼠，表明失重大鼠在遭受細菌感染時，該黏附分子表達增加，肺組織受損更重。

他汀類是一種重要的用來抑制膽固醇生物合成的藥物，近年來該類藥物的其他生物效應逐漸顯現，并成為研究熱點。研究顯示，他汀對參與免疫及炎性反應的基因有調節效應，從而對感染和腫瘤產生保護作用[13-14]。有報道認為他汀類藥物可改善肺炎患者的生存率[15]。Hennessy等[16]研究證實辛伐他汀對肺上皮細胞感染銅綠假單胞菌后，參與宿主反應的基因表達產生影響。他汀類產生這種保護作用的機制可能是通過作用于細菌和真菌表面抗原進而抑制促炎細胞因子IL-8的活化[17]。

我們研究發現，模擬失重狀態下肺炎鏈球菌感染導致肺部炎性反應較地面自由活動大鼠更為嚴重，中性粒細胞及重要黏附分子之一CD11b/c可能發揮著重要作用。我們采用近年來熱點研究藥物他汀類對感染大鼠進行干預，結果顯示失重大鼠肺部感染肺炎鏈球菌時，阿托伐他汀可減少肺組織損傷，降低炎性反應，起到一定保護作用，但具體機制以及是否通過CD11b/c發揮作用，尚需進一步研究。

本研究通過阿托伐他汀對失重大鼠肺炎鏈球菌模型進行干預，觀察中性粒細胞及其黏附分子的表達，證實該藥物對模擬失重下的肺感染有一定的保護作用。但人類與大鼠在生物特性上有一定差異，藥物代謝特點也有所不同，因此需進一步研究以篩選有效安全的藥物，為航天醫療保障提供理論依據。

[1] Limper U, Gauger P, Beck P,etal. Interactions of the human cardiopulmonary, hormonal and body fluid systems in parabolic flight[J].Eur J Appl Physiol, 2014,114(6):1281-1295.

[2] Baqai F P, Gridley D S, Slater J M,etal. Effects of spaceflight on innate immune function and antioxidant gene expression[J].J Appl Physiol(1985), 2009,106(6):1935-1942.

[3] 陳杰,馬進,丁兆平,等.一種模擬長期失重影響的大鼠尾部懸吊模型[J].空間科學學報,1993,13(2):159-162.

[4] 韓剛，張兆洋，孫喜慶，等.失重或模擬失重對血管內皮細胞影響的研究進展[J].解放軍醫學院學報,2013,34(12):1288-1290.

[5] 王俊峰,劉長庭,王德龍,等.模擬失重大鼠肺組織損傷發生機制[J].解放軍預防醫學雜志,2007,25(3):164-166.

[6] 裴士杰,王萍,朱敏立.失重對呼吸系統影響的研究進展[J].國際呼吸雜志,2011,31(21):1677-1680.

[7] 裴士杰,朱敏立,易勇,等.模擬失重狀態下大鼠抗肺炎鏈球菌感染能力的變化[J].中華結核和呼吸雜志,2012,35(7):515-519.

[8] Gridley D S, Mao X W, Stodieck L S,etal. Changes in mouse thymus and spleen after return from the STS-135 mission in space[J].PLoS One, 2013,8(9):e75097.

[9] Qu L, Chen H, Liu X,etal. Protective effects of flavonoids against oxidative stress induced by simulated microgravity in SH-SY5Y cells[J].Neurochem Res, 2010,35(9):1445-1454.

[10]Cui Y, Zhou J, Li C,etal. Effects of simulated weightlessness on liver Hsp70 and Hsp70mRNA expression in rats[J].Int J Clin Exp Med, 2010,3(1):48-54.

[11]Koh A Y, Priebe G P, Ray C,etal. Inescapable need for neutrophils as mediators of cellular innate immunity to acute Pseudomonas aeruginosa pneumonia[J].Infect Immun, 2009,77(12):5300-5310.

[12]Schymeinsky J, Mócsai A, Walzog B. Neutrophil activation via beta2 integrins (CD11/CD18): molecular mechanisms and clinical implications[J].Thromb Haemost, 2007,98(2):262-273.

[13]Kouroumichakis I, Papanas N, Proikaki S,etal. Statins in prevention and treatment of severe sepsis and septic shock[J].Eur J Intern Med, 2011,22(2):125-133.

[14]謝湘竹,趙水平,于碧蓮,等.阿托伐他汀對氧化型低密度脂蛋白刺激下脂肪細胞分泌功能的影響[J].解放軍醫藥雜志,2012,24(5):4-7.

[15]Chalmers J D, Singanayagam A, Murray M P,etal. Prior statin use is associated with improved outcomes in community-acquired pneumonia[J].Am J Med, 2008,121(11):1002-1007.

[16]Hennessy E, O'Callaghan J, Mooij M J,etal. The impact of simvastatin on pulmonary effectors of pseudomonas aeruginosa infection[J].PLoS One, 2014,9(7):e102200.

[17]Jouneau S, Bonizec M, Belleguic C,etal. Anti-inflammatory effect of fluvastatin on IL-8 production induced by pseudomonas aeruginosa and Aspergillus fumigatus antigens in cystic fibrosis[J].PLoS One, 2011,6(8):e22655.

Protective Effect of Atorvastatin on Streptococcus Pneumoniae Infections in Rats under Simulated Weightless Condition

ZHU Min-lia, WANG Xiao-huia, WANG Pinga, LI Yue-yuea, CUI Yanb

(a. Department of Critical Care and Respiratory Diseases, b. Department of General Surgery, 306 Hospital of PLA, Beijing 100101, China)

Objective To investigate the effect of Atorvastatin on pulmonary infection induced by Streptococcus pneumonia in rats under simulated weightless condition, and to provide the theoretical basis for protection of respiratory system and infection therapy for astronauts. Methods A total of 40 Wistar rats were randomly divided into weightlessness + infection group (WI group,n=10), weightlessness + infection + statin group (WIS group,n=10), control + infection group (CI group,n=10) and control + infection + statin group (CIS group,n=10). The models of simulated weightlessness were established in WI and WIS groups, while the rats in CI and CIS groups were fed in mouse cages with free running space. Bacterial pneumonia models were established in the 4 groups after the rats had been fed for 3 d. WIS and CIS groups were treated with Atorvastatin 10 mg/(kg·d) via intragastric administration on the first experiment day, while WI and CI groups were treated with same volume of sterile water via intragastric injection. The rats were killed at the end of tail-suspension for 8 d. The routine blood test and level of CD11b/c of neutrophilic granulocyte in the blood samples were detected, and the pathological changes of lung tissues in slices were observed. Results In the four groups, local congestion and spot-film hemorrhage in different degrees were found in the surfaces of lung tissues by macroscopic observation; inflammatory cells were infiltrated in the interstitial alveolar space which was mainly a large number of neutrophils under the microscope, and some parts of constructions in the alveolar space disappeared. All of the above pathological changes showed that WI group was the severest, and CIS group was the least, and the changes were more prominent in superior lobe of rats under simulated weightlessness. There were significant differences in white blood cells and neutrophilic granulocyte counts in the four groups (F=3.67，P<0.05；F=7.47，P<0.01), and the values were the highest in WI group and the lowest in CIS group. There were significant differences in CD11b/c value in the four groups (P<0.01), and the value was the highest in WI group (167.75±28.39) and the lowest in CIS group (115.57±18.57). No significant differences were found in NEU percentage (NEU%) in the four groups (P>0.05). Conclusion Pulmonary infection induced by Streptococcus pneumonia in rats under simulated weight condition, is more serious in inflammatory reaction and pathological lesions, while Atorvastatin may have protective effects on lung tissues under weight condition.

Weightlessness simulation； Rats, Wistar； Atorvastatin; Streptococcus pneumoniae

全軍醫學科研“十二五”重點項目(BWS11J051)

100101 北京，解放軍306醫院呼吸與重癥醫學科(朱敏立、王小輝、王萍、李月越)，普通外科(崔彥)

王萍，E-mail：pingwang306hpbj@163.com

R856

A

2095-140X(2015)06-0006-04

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.06.002

2015-01-12 修回時間：2015-02-09)