N-乙酰半胱氨酸對模擬失重大鼠肺損傷的防護作用研究

李月越,王 萍,朱敏立,趙雅輝,王小輝,崔 彥

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·論著·

N-乙酰半胱氨酸對模擬失重大鼠肺損傷的防護作用研究

李月越,王 萍,朱敏立,趙雅輝,王小輝,崔 彥

目的 觀察N-乙酰半胱氨酸(NAC)對模擬失重狀態下大鼠肺損傷的影響。方法 采用大鼠尾吊法建立模擬失重大鼠模型。清潔級Wistar大鼠24只，隨機分為A組、B組和C組，每組各8只。從實驗第1天開始B組每天給予N-乙酰半胱氨酸300 mg/kg藥物灌胃，A組、C組予以等量無菌注射用水灌胃。第2天A、B兩組進行持續尾吊建立模擬失重模型，C組大鼠于籠內自由活動，7天后將所有大鼠處死取材，測定血中性粒細胞表面CD11b/c、中性粒細胞活性氧濃度，白介素-10(IL-10)、白介素-6(IL-6)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量。取右肺上葉組織，切片行HE染色，觀察肺組織結構變化。結果 A組顯微鏡下肺泡大小不一致，肺泡間隔水腫增寬，血管擴張充血，間質內可見中性粒細胞、淋巴細胞浸潤。B組肺組織亦出現上述改變，但程度較A組輕，C組未見明顯上述改變。各組間CD11b/c、活性氧(ROS)、TNF-α、IL-10、IL-6比較差異均有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。結論 N-乙酰半胱氨酸能夠減輕模擬失重狀態下大鼠炎性反應和肺組織破壞，其抗氧化應激作用可能對肺組織損傷有一定保護作用。

模擬失重；大鼠, Wistar； N-乙酰半胱氨酸；保護作用

隨著載人航天事業的不斷發展，失重狀態對人體各系統影響的研究日趨深入。肺是易受重力影響的器官之一。失重時下肢血液涌入低阻力、高順應性、高流量的肺循環，造成肺組織淤血，嚴重者可誘發急性肺損傷。本研究篩選出近年證實具有抗氧化應激作用的N-乙酰半胱氨酸(n-acetys cysteine, NAC)，通過對失重狀態下的大鼠進行干預，觀察其與對照組大鼠的肺組織病理及中性粒細胞CD11b/c、中性粒細胞活性氧(reactzve oxygen species, ROS)濃度及白介素-10(IL-10)、白介素-6(interlevkin-6, IL-6)及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)等炎性細胞因子的比較，研究N-乙酰半胱氨酸對失重狀態下肺是否有保護作用，為航天醫學研究及臨床防治急性肺損傷提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與實驗動物

1.1.1 主要試劑： Anti-Rat CD11b/c PE、Anti-Rat Granulocyte Marker FITC購自美國eBioscience公司，大鼠IL-10、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒購自美國eBioscience公司，大鼠中性粒細胞分離液試劑盒購自天津灝洋生物制品科技有限公司，活性氧檢測試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司。

1.1.2 實驗動物： 健康清潔級雄性Wistar大鼠24只，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，體重為(270±20)g。

1.2 方法

1.2.1 尾吊大鼠模型的建立：雄性Wistar大鼠24只，按照隨機數字表法分為A組、B組和C組，每組各8只。實驗第1天稱重，B組每天給予NAC 300 mg/kg灌胃[1]，A組及C組每天給予注射用無菌用水1 ml等量灌胃。實驗第2天按照文獻[2-3]的方法對A、B兩組大鼠建立尾吊大鼠模型：每個鼠籠內尾吊1只大鼠，使大鼠前肢踏于籠底，尾部懸于籠頂，后肢懸空完全解除負荷，身體縱軸與水平面約成30°。C組大鼠于鼠籠內自由活動。實驗環境為室溫(22℃)，晝夜周期均為12 h，實驗過程中所有大鼠可以自由進食、飲水。第8天處死實驗大鼠，并進行取材、病理檢查。

1.2.2 IL-10、IL-6、TNF-α及全血標本的處理：實驗第8天取材，行局部麻醉后經腹中動脈取血，每只小鼠采集血液分別置于生化管中，于取血后2 h內，3000 r/min離心10 min后，取上部血清，保存于-80℃冰箱中待檢。用ELISA法檢測血液中炎性細胞因子IL-10、IL-6及TNF-α，按說明書操作。

1.2.3 中性粒細胞CD11b/c流式細胞儀檢測：參照大鼠中性粒細胞分離液說明書分離中性粒細胞，取大鼠新鮮抗凝血1 ml，與全血及組織稀釋液1∶1混勻后小心加入到1 ml分離液的液面上，以2000 r/min(半徑15 cm水平轉子)離心30 min，此時離心管中由上至下細胞分為4層。第1層為血漿層，第2層為單核細胞層，第3層為富集一定中性粒細胞的分離液層，第4層為紅細胞層(含有一定中性粒細胞)。收集第3層和第4層，放入盛有2 ml細胞洗滌液的試管中，充分混勻后，以2000 r/min離心30 min，棄去上清液，加入6～10倍細胞體積的紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1～2 min，以2000 r/min離心5 min，棄去紅色上清，加入適量PBS溶液，重懸沉淀，2000 r/min離心5 min，重復1次，分離率為80%以上。1 ml PBS溶液配成中性粒細胞懸液，取500 μl的中性粒細胞懸液，加入1 μl Anti-Rat Granulocyte Marker FITC，5 μl Anti-Rat CD11b/c PE充分混勻，室溫避光20 min，于中性粒細胞段開窗，測定CD11b/c熒光強度(mean fluorescence intensity， MFI) 。同時對各標本作陰性對照，除以等量同IgG-FITC抗體代替CD11b/c-FIT C抗體,每個樣本檢測10 000個細胞。

1.2.4 中性粒細胞ROS的檢測：采用雙乙酰基二氯熒光素(DCFH-DA)作為細胞內活性氧檢測探針。在活性氧存在時，DCFH被氧化為不能透過細胞膜的強綠色熒光物質，其熒光在激發波長502 nm,發射波長530 nm附近有最大波峰，強度與細胞內活性氧水平成正比。首先將DCFH-DA工作濃度調整為20 μmol/L備用。取剩余500 μl的中性粒細胞懸液室溫2000 r/min離心，棄去上清液，加入1 ml配好的DCFH-DA避光37℃水浴40 min。室溫2000 r/min離心，去上清液，用PBS洗滌2次后重懸，配成500 μl的細胞懸液，將流式細胞儀(美國BD公司)按激發波長502 nm,發射波長530 nm調好后，進行檢測。

1.2.5 肺組織病理學檢查：實驗第8天取材，每組均取右肺上葉組織，4%多聚甲醛固定，切片行HE染色，光學顯微鏡觀察。

2 結果

2.1 肺組織病理結構改變 A組病變最嚴重，顯微鏡下可見肺泡大小不一致，肺泡間隔水腫增寬，血管擴張充血，間質內可見中性粒細胞、淋巴細胞浸潤。B組顯微鏡下可見肺泡大小稍不一致，肺泡間隔增寬，間質內少量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，程度較A組明顯減輕。C組顯微鏡下可見肺泡大小一致，肺泡間隔未見明顯增厚，血管無擴張充血，間質內可見極少量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，見圖1。

A組 B組 C組

圖1 光鏡下3組大鼠肺組織病理學形態(HE×100)

A組建立尾吊大鼠模型，每天給予注射用無菌用水1 ml等容量灌胃；B組建立尾吊大鼠模型，給予N-乙酰半胱氨酸 300 mg/(kg·d)灌胃；C組于鼠籠內自由活動，每天給予注射用無菌用水1 ml等容量灌胃

2.2 血中性粒細胞CD11b/c、活性氧(ROS)檢測結果 3組間中性粒細胞CD11b/c和ROS比較差異具有統計學意義(P<0.01)，兩兩比較顯示，A組中性粒細胞CD11b/c和ROS高于B組(t=62.82，P<0.01；t=181.84，P<0.01)和C組(t=143.67，P<0.01；t=2279.87，P<0.01)，見表1。

表1 3組大鼠中性粒細胞CD11b/c、活性氧的比較

注：A組建立尾吊大鼠模型，每天給予注射用無菌用水1 ml等容量灌胃；B組建立尾吊大鼠模型，每天給予N-乙酰半胱氨酸 300 mg/(kg·d)灌胃；C組于鼠籠內自由活動，每天給予注射用無菌用水1 ml等容量灌胃

2.3 TNF-α、IL-10及IL-6檢測結果 3組間TNF-α、IL-10和IL-6比較差異具有統計學意義(P<0.05，P<0.01)，A組血清TNF-α、IL-10、IL-6高于B組(t=273.47，P<0.01；t=39.89，P<0.01;t=6.36，P<0.05)和C組(t=226.43,P<0.01；t=492.12，P<0.01;t=137.41，P<0.01)，見表2。

3 討論

人類長期在地球引力下生活，已經適應了重力對人體的作用。隨著我國載人航天事業飛速發展，宇航員須在脫離地球重力環境下生存和完成各種任務。探索和明確失重狀態下航天員機體各器官系統的變化也變得愈加緊迫和重要，其中肺組織是對重力改變較為敏感的器官之一，失重會造成肺損傷，在肺組織損傷過程中，會出現急性炎性反應，故一些炎性細胞因子也會隨之發生一系列變化[4-6]。受宇航員數量、實驗設備及條件等諸多因素限制，目前國內外大多采用動物模型來模擬失重或微重力狀態，經典方法為大鼠尾吊模型，進行地面課題研究[7-8]。本課題組前期研究及國內外其他學者研究發現，模擬失重狀態下機體原有內環境穩態被打破，導致免疫系統出現功能失調，機體易患多種感染性疾病，機體的炎性反應增強，從而導致肺損傷，在肺損傷過程中多數細胞因子發生變化，如TNF-α及IL-6等[6,9]。

表2 3組大鼠血清TNF-α、IL-10、IL-6指標比較

注：IL-10為白介素-10，IL-6為白介素-6，TNF-α為腫瘤壞死因子-α；A組建立尾吊大鼠模型，每天給予注射用無菌用水1 ml等容量灌胃；B組建立尾吊大鼠模型，每天給予N-乙酰半胱氨酸300 mg/(kg·d)灌胃；C組于鼠籠內自由活動，每天給予注射用無菌用水1 ml等容量灌胃

NAC是細胞內還原型谷胱甘肽(GSH)的前體，具有多種藥理作用，可增加機體抗氧化能力，清除自由基，減少ROS，抑制TNF-α等所致細胞核因子NF-κB的活性，阻斷NF-κB信號轉導途經，下調IL-8、IL-6的表達，抑制炎性反應，對多種類型的急性肺損傷均有較明顯的保護作用[10-11]。研究發現，A組大鼠肺組織損傷明顯，肺泡大小不一，間隔增寬增厚，間質內較多中性粒細胞、淋巴細胞浸潤；而B組的肺組織損傷減輕，間質內中性粒細胞明顯減少，提示NAC可有效減輕模擬失重狀態下大鼠肺組織傷害。

正常情況下，CD11b主要儲存在胞質顆粒中，在細胞膜表面低水平表達，受細菌脂多糖、IL-8等刺激后，在細胞膜表面大量表達，對宿主炎性反應早期非特異性免疫功能的發揮起關鍵作用，還可通過延遲炎性細胞凋亡、誘導炎性介質大量釋放，故被認為是中性粒細胞激活的標志[12-13]。ROS是指分子氧單電子還原后生成的化學反應性質活潑的某些氧代謝產物及其衍生物，在感染性疾病和某些因素刺激下，使呼吸氧爆發過于激烈，從而釋放大量ROS，造成正常組織的損害，它是機體的炎性指標之一，研究表明NAC可減少ROS生成及減輕肺損傷，能減少CD11b在中性粒細胞表面的表達并降低中性粒細胞內ROS濃度，從而減輕炎性反應和肺損傷[14-15]。

IL-6是至今發現的生物學活性最廣泛的細胞因子，具有抗炎和促炎雙相的多效性因子，可以調節免疫應答，促進B細胞的增殖和分化。IL-10是一種重要的具有免疫調節作用的細胞因子，主要是由單核-巨噬細胞和各種亞群的T細胞合成分泌的一種具有多功能的抑制性細胞因子，能夠減少中性粒細胞在肺內的募集，降低呼吸膜的通透性，從而減輕肺部炎性反應，與炎癥程度呈正相關。TNF-α是誘導細胞凋亡，加重損傷的重要因子。以上炎性細胞因子可通過趨化、活化淋巴細胞、中性粒細胞等，產生免疫病理損傷，并可直接作用于細胞、微血管等，造成組織損傷[16-18]。本研究結果表明，A組的IL-6、IL-10及TNF-α炎性因子水平均最高，而B組的炎性因子水平均下降，說明NAC有減輕失重環境變化導致肺的炎性反應，具有保護肺組織的作用，可能成為未來航天醫療保護可供篩選的藥物之一。

綜上所述，NAC抗氧化作用能夠減輕模擬失重狀態下大鼠的炎性反應，可有效保護肺組織，減輕由失重所致的肺損傷。本研究不僅為今后航天醫療保障提供了科學實驗數據，且臨床上有大量長期臥床患者，而長期臥床對患者生理和病理生理變化的負面影響與失重引起的反應機制相似，故對該類患者呼吸系統疾病及肺損傷的防治可能亦有重要意義。

[1] Hogen T, Demel C, Giese A,etal. Adjunctive N-acetyl-l-cysteine in treatment of murine pneumococcal meningitis[J].Antimicrob Agents Chemother, 2013,57(10):4825-4830.

[2] 陳杰,馬進,丁兆平,等.一種模擬長期失重影響的大鼠尾部懸吊模型[J].空間科學學報,1993,13(2):159-162.

[3] 王承珉,張汝果,付宏偉.尾懸吊模擬失重對大鼠肺臟的影響[J].航天醫學與醫學工程,1995,8(4):164-166.

[4] 韓剛,張兆洋,孫喜慶,等.模擬或失重對血管內皮細胞影響的研究進展[J].解放軍醫學院學報,2013,34(12):1288-1290.

[5] 王俊鋒,劉長庭,王德龍,等.模擬失重大鼠肺組織損傷發生機制[J].解放軍預防醫學雜志,2007,25(3):164-166.

[6] 裴士杰,王萍,朱敏立.失重對呼吸系統影響的研究進展[J].國際呼吸雜志,2011,31(21):1677-1680.

[7] 宮宇,沈斌,陳林,等.模擬失重對大鼠血液電阻抗譜影響的實驗研究[J].中國生物醫學工程學報，2012,31(6):853-858.

[8] 董麗,王瓊,劉新民,等.地面模擬失重實驗方法概況[J].中國實驗動物學報,2013,21(5):90-94.

[9] 裴士杰,朱敏立,易勇,等.模擬失重狀態下大鼠抗肺炎鏈球菌感染能力的變化[J].中華結核和呼吸雜志,2012,35(7):515-519.

[10]張錚,沈華,秦海東,等.N-乙酰半胱氨酸對大鼠肺缺血/再灌注損傷誘導細胞凋亡的保護機制[J].中國危重病急救醫學,2012,24(2):111-115.

[11]Chiang C H, Chuang C H, Liu S L,etal. N-acetylcysteine attenuates ventilator-induced lung injury in an isolated and perfused rat lung model[J].Injury, 2012,43(8):1257-1263.

[12]Schymeinsky J, Mócsai A, Walzog B. Neutrophil activation via beta2 integrins (CD11/CD18): molecular mechanisms and clinical implications[J].Thromb Haemost, 2007,98(2):262-273.

[13]劉海英.缺氧缺血性腦病新生兒血清白細胞介素-8水平和中性粒細胞表面粘附分子CD11b表達的變化[J].實用兒科臨床雜志, 2012,27(20):1592-1593.

[14]Bulger E M, Garcia I, Maier R V. Intracellular antioxidant activity is necessary to modulate the macrophage response to endotoxin[J].Shock, 2002,18(1):58-63.

[15]Moon C, Lee Y J, Park H J,etal. N-acetylcysteine inhibits RhoA and promotes apoptotic cell clearance during intense lung inflammation[J].Am J Respir Crit Care Med, 2010,181(4):374-387.

[16]楊璐瑜.哮喘患者血清IL-6、TNF-α、IL-10表達變化與氣道炎癥的關系探討[J].臨床肺科雜志,2013,18(8):1389-1391.

[17]李玉秀,苗英慧.支氣管哮喘患者血清IL-6、IL-10及TNF-α的表達水平及臨床意義[J].醫學理論與實踐,2014,27(13):1695-1696,1707.

[18]徐一凱,楊珺超.防感煎劑對H1N1病毒感染小鼠TNF-α、IL-6的影響[J].云南中醫學院學報,2014,37(1):12-14,25.

Protective Effect of N-acetylcysteine on Pulmonary Injury under Simulated Weightless Condition in Rats

LI Yue-yuea, WANG Pinga, ZHU Min-lia, ZHAO Ya-huia, WANG Xiao-huia, CUI Yanb

(a. Department of Critical Care and Respiratory Diseases, b. Department of General Surgery, 306 Hospital of PLA, Beijing 100101, China)

Objective To observe the effect of N-acetylcysteine (NAC) on pulmonary injury under simulated weightlessness in rats. Methods Tail-suspension method was used to establish the models of weightless simulation in rats. A total of 24 clean Wistar rats were randomly divided into group A, B and C (n=8 for each group). Group B was treated with NAC (300 mg/kg) by intragastric administration every day from the first day, while group A and C were treated with same volume of sterile water via intragastric injection. The models of weightless simulation were established in group A and B by tail-suspension method after the rats had been administrated for 2 d, while the rats in group C were free-running in the cage. The rats were killed at the end of the 7thd. The levels of superficial CD11b/c of neutrophilic granulocyte, reactive oxygen species (ROS) concentration of neutrophilic granulocyte, contents of IL (interleukin)-10, IL-6 and TNF (tumor necrosis factor)-α in the blood samples were detected. The superior lobe tissues of right lung were given hematoxylin and eosin stain (HE stain), and the pathological changes of lung tissues in slices were observed. Results In group A, under microscope, the sizes of alveoli were discrepant, the alveolar septum became wide with edema, and blood vessels were dilated and congested, and neutrophils and infiltrated lymphocytes were found in the interstitial. Similar changes of group A were found in group B, but the degrees were less than those in group A, while there were no obviously similar changes in group C. There were statistically significant differences in CD11b/c, ROS concentration, TNF-α, IL-10 and IL-6 (P<0.05,P<0.01). Conclusion NAC can alleviate inflammation and lung damages of rats under simulated weightlessness, and the antioxidation effect of NAC may play a role in protection of lung injury under weightless condition.

Weightlessness simulation； Rats, Wistar； N-acetylcysteine； Protective effect

全軍醫學科研“十二五”重點項目(BWS11J051)

100101 北京，解放軍306醫院呼吸與重癥醫學科(李月越、王萍、朱敏立、趙雅輝、王小輝)，普通外科(崔彥)

王萍，E-mail：pingwang306hpbj@163.com

R856

A

2095-140X(2015)06-0010-04

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.06.003

2015-02-07 修回時間：2015-03-01)