Hes-1和干擾素在丙型肝炎病毒感染中的檢測意義

郭連峰，邱 雷，李 娜，杜紅麗，張建東

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·論著·

Hes-1和干擾素在丙型肝炎病毒感染中的檢測意義

郭連峰，邱 雷，李 娜，杜紅麗，張建東

目的 探討Notch信號通路中的靶基因Hes-1和IFN-α、IFN-β、IFN-γ三種干擾素與丙型肝炎病毒(HCV)感染的關系。方法 選取2012年11月—2014年10月在我院就診的125例HCV感染患者，根據是否轉歸為肝硬化分為HCV感染組和HCV肝硬化組，同期選取100例健康人為對照組。采集HCV肝硬化組、HCV感染組和對照組晨起空腹靜脈血3 ml，分離出單個核細胞，提取RNA，將其反轉錄為cDNA，應用實時定量RT-PCR技術檢測Hes-1和IFN-α、IFN-β、IFN-γ。結果 3組Hes-1和IFN-α、IFN-β、IFN-γ水平之間比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。結論 Notch信號通路中的靶基因Hes-1和IFN-α、IFN-β、IFN-γ在HCV慢性感染時明顯升高，且在HCV感染導致的肝硬化中，Hes-1和IFN-α、IFN-β、IFN-γ的水平更高。

丙型肝炎；Hes-1；干擾素類

丙型肝炎病毒(hepatitis c viros, HCV)感染是慢性肝炎的常見的病因之一。目前全球約有1.85億HCV感染者，其中大約1.5億是慢性感染。每年約有300萬的HCV新增感染病例，其中70%～85%均發展為慢性肝炎，最終進展為肝硬化及肝細胞癌的不在少數。HCV感染非常隱匿，感染初期無任何癥狀，目前人們對HCV感染的危害性認識不足，所以延誤治療，錯失最佳治愈的時機[1]。

Notch基因在20世紀初被發現，Notch信號通路通過細胞之間相互接觸的旁分泌，直接將其轉化為基因表達的改變[2]。Notch信號分子及其目的基因在細胞增殖、分化、凋亡過程中起著重要的作用，Hes-1是Notch信號通路下游、影響細胞增殖及分化的靶基因。研究表明，Notch信號通路對于炎癥的發生與進展有很大關系[3]。干擾素(IFN)是1957年被發現的。它是一種分泌性蛋白，具有廣譜的抗病毒、抗腫瘤和免疫調節功能，根據產生干擾素的細胞來源不同，IFN可以分為IFN-α、IFN-β、IFN-γ3種[4]。有文獻報道， IFN在病毒性肝炎中的表達水平會明顯升高[5]。本文主要研究Hes-1、IFN-α、IFN-β、IFN-γ與丙型肝炎進展的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象與分組 收集2012年11月—2014年10月在我院就診的125例HCV感染者臨床資料，其中男69例，女56例。年齡21～76歲，平均年齡41.9歲。分析HCV感染病例的病理及影像學資料，發現有32例已轉歸為肝硬化，將之歸為HCV肝硬化組，其中男19例，女13例，年齡(62.3±13.5)歲，體重(59.3±17.1)kg。其余93例歸為HCV感染組，其中男42例，女49例，年齡(43.5±19.4)歲，體重(61.5±15.6)kg。同期收集100例健康人作為對照組，其中男59例，女41例，年齡(41.7±20.5)歲，體重(60.2±13.5)kg。3組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑：熒光定量PCR儀為上海宏石醫療科技有限公司生產。人淋巴細胞分離液為北京Solarbio公司生產。Total RNA提取試劑為寶生物工程有限公司生產。PCR反應體系為康為世紀公司生產。PCR引物為英濰捷基(上海)公司生產。

1.2.2 提取單個核細胞：采集3組晨起空腹靜脈血3 ml。室溫18～28℃在生物安全柜中操作以避免微生物的污染，將新鮮抗凝血2 ml與Hank's液1：1混勻，沿管壁緩慢地加在2 ml人淋巴細胞分離液的液面上，然后1500 r/min離心(半徑15 cm的水平轉子)15 min，此時離心管中由上到下細胞分為4層。小心地收集第2層環狀乳白色的淋巴細胞或單核細胞層，將反復洗2次得到的細胞加入Trizol試劑0.6 ml/管并混勻，勻漿裂解液放在-80℃低溫冰柜保存，以備集中提取RNA。

1.2.3 RNA提取：取出前面提取的勻漿裂解液，加入氯仿(1/5體積量)，蓋緊離心管管蓋，用手劇烈振蕩15 s，室溫靜置5 min后12 000 r/min，4℃離心15 min；小心取出離心管，吸取上清液轉移到另一個新的離心管中(不能吸出白色中間層)；加入1 ml異丙醇，上下顛倒充分混勻，室溫靜置10 min；最后12 000 r/min，4℃離心10 min后得到RNA沉淀。對沉淀進行清洗和溶解后-80℃低溫保存。

1.2.4 RNA濃度的測定：取一定量的RNA提取物，用DEPC水稀釋n倍，用DEPC水將分光光度計調零，取稀釋液進行OD260/OD280測定，按照以下公式進行RNA濃度的計算：終濃度(ng/μl)=OD260×稀釋倍數×40，RNA純度OD260/OD280比值1.8～2.1。

1.2.5 反轉錄步驟：將1 μl的Random 6，1 μl N9，3 μl已提取的RNA，7.5 μl的DEPC水，體積共為12.5 μl，混勻，置于干熱恒溫器上65℃，5 min。然后加入4 μl的5×Buffer，2 μl的Dntp,1 μl的Transcriptase和0.5 μl的Rnaseinhibitor，置于水浴箱42℃，1 h，最后置于干熱恒溫器上，70℃，10 min。

1.2.6 聚合酶鏈反應(PCR)擴增：嚴格按照操作說明書操作，PCR引物為英濰捷基(上海)公司生產，引物的名稱與序列，見表1。

注： IFN-α為α干擾素；IFN-β為β干擾素；IFN-γ為γ干擾素

1.2.7 計算方法:①實驗組CT值減去實驗組內參CT值，得到ΔCT1。②對照組CT值減去對照組內參CT值，得到ΔCT2，計算出平均ΔCT2。③ΔCT1減去平均ΔCT2，得到ΔΔCT。④計算出2-ΔΔCT為最終數據，進行統計分析[6]。

2 結果

與對照組比較，HCV感染組和HCV肝硬化組Hes-1、IFN-α、IFN-β、IFN-γ表達水平升高(P<0.05)，與HCV肝硬化組比較，HCV感染組Hes-1、IFN-α、IFN-β、IFN-γ表達水平降低(P<0.05)，見表2。

表2 3組Hes-1、IFN-α、IFN-β和IFN-γ表達水平比較

注：IFN-α為α干擾素；IFN-β為β干擾素；IFN-γ為γ干擾素;與對照組比較,aP<0.05;與HCV肝硬化組比較,cP<0.05

3 討論

HCV感染十分常見，由于HCV抗原結構的特殊性，目前還沒有直接檢測血清中HCV抗原的技術，但直接檢測抗體又存在滯后性，所以要控制HCV的傳播、提高丙型肝炎的治療效果急需及時、穩定和準確的實驗室診斷與支持[7]。另外目前預防HCV感染還沒有有效疫苗，也沒有有效的治愈方法。因此，控制HCV感染只能從傳染源和傳播途徑入手，早期診斷和發現HCV感染者就是最為有效的手段[8]。

Notch信號通路是調節細胞增殖和分化的重要通路，研究表明，Notch信號通路對多種疾病的發生、發展都有重要的影響，HCV感染主要引起肝臟的炎癥病變，Notch信號通路也參與其中[9]，Hes-1是Notch信號通路的靶基因，與多種疾病的進展均有重大的關系。國內外文獻報道鮮有Hes-1與丙型肝炎的關系的報道，曾有文獻報道Hes-1在急性乙型肝炎患者CD8+ T細胞中表達明顯升高，這與本文在丙型肝炎中的檢測結果一致[10]。本文研究了Hes-1與丙型肝炎的關系，人體存在丙肝病毒感染時，Hes-1水平隨即升高，當病毒感染得不到有效遏制而出現肝硬化時Hes-1水平升高更加顯著。干擾素是一組由單核細胞和淋巴細胞產生的細胞因子，它們在同種細胞上具有廣譜的抗病毒、影響細胞生長，以及分化、調節免疫功能等多種生物活性。張艷寧等曾報道，干擾素α在乙肝病毒相關腎炎患者血清中表達水平明顯升高[11]。丙型肝炎是由丙肝病毒感染引起的肝臟炎癥，研究干擾素與丙型肝炎的關系是十分有必要的。本研究發現丙肝患者體內的干擾素表達水平比健康人顯著升高，這與文獻報道相似。

通過本研究可以得知，HCV感染可以引起Hes-1、IFN-α、IFN-β、IFN-γ表達水平明顯升高，其中以Hes-1表達水平升高最為明顯，這說明Hes-1作為Notch基因的靶基因，在丙型肝炎的發生和發展中，起到非常重要的作用。丙肝患者感染后很少出現特異性癥狀，很多人一直到發生肝硬化或肝細胞癌等相關癥狀時才檢出HCV感染[12-14]。不僅如此，HCV在患者體內的自發清除率低，大部分會慢性化發展[15]。因此本研究相信Hes-1和IFN-α、IFN-β、IFN-γ等因子在丙型肝炎的診斷、病情評估和治療方面將會發揮較好的臨床參考價值。

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Value of Hes-1 and Interferon in Detection of Hepatitis C Virus Infection

GUO Lian-fenga， QIU Leib， LI Nac， DU Hong-lia， ZHANG Jian-donga

(a. Department of Clinical Laboratory, b. Department of Pathology, c. Emergency Department, the People's Hospital of Hengshui, Hengshui, Hebei 053000, China)

Objective To investigate the relationships between Hes-1 target gene of Notch signaling pathways and interferon-α (IFN-α), IFN-β and IFN-γ and hepatitis C virus (HCV) infection. Methods A total of 125 HCV inpatients admitted during November 2012 and October 2014 were divided into hepatic cirrhosis group (HC group,n=32) and HCV infection group (HCV infection group,n=93), while 100 healthy people at the same period were selected as control group. Samples of 3 ml venous blood with empty stomach in the morning were obtained from HC group, HCV infection group and control group, and mononuclear cells were isolated, RNA was extracted, and then obtained the reverse transcription of cDNA was performed. The levels of Hes-1, IFN-α, IFN-β and IFN-γ were detected using real-time quantitative RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) method. Results The differences in levels of Hes-1, IFN-α, IFN-β and IFN-γ in the three groups were statistically significant (P<0.05). Conclusion Hes-1 target gene of Notch signaling pathways and Hes-1, IFN-α, IFN-β and IFN-γ levels are significantly increased in HCV patients with chronic infection, but the levels are even more increased in hepatic cirrhosis induced by HCV infection.

Hepatitis C； Hes-1; Interferons

河北省衡水市科技局項目(13020z)

053000 河北 衡水，衡水市人民醫院檢驗科(郭連峰、杜紅麗、張建東)，病理科(邱雷)，急診科(李娜)

R512.63

A

2095-140X(2015)06-0028-03

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.06.007

2015-02-01 修回時間:2015-02-27)