肉桂對糖尿病大鼠海馬突觸可塑性的影響*

楊坦

糖尿病（diabetes mellitus，DM）和阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是臨床上常見的慢性疾病[1-2]。阿爾茨海默病是以學習能力退化、記憶喪失和紊亂為特征的神經系統退行性病變，而糖尿病常出現廣泛的并發癥，包括外周和中樞神經系統損害[3-6]。阿爾茨海默病與糖尿病的關聯受到越來越多的關注，據報道糖尿病患者患阿爾茨海默病的風險增高[7]。胰島素失調導致腦內信號分子紊亂，伴隨著出現認知障礙，但糖尿病學習記憶損傷的具體機制不明。海馬是關聯學習記憶功能以及神經系統重大疾病的重要結構，長時程增強（Long-term potentiation，LTP）一直被認為是海馬參與學習記憶的基礎方式[8]。肉桂（Cinnamomum cassia，CE）是臨床中廣泛應用的傳統中藥，具有補火助陽，引火歸源，散寒止痛，活血通經的功效，神農本草經中將其譽為上品。近年來的研究發現肉桂具有抗糖尿病、抗氧化、抗炎的作用[9]。本文通過建立糖尿病模型，觀察肉桂對糖尿病大鼠海馬突觸可塑性的影響，并探討其潛在機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 肉桂（產地：越南）購自河南省南陽市濟康醫藥公司，粉碎機100目粉碎后備用；鏈脲菌素（streptozotocin，STZ）購于Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒（武漢博士德公司）；N-甲基-D-天門冬氨酸受體2B亞型（NMDAR2B，NR2B）抗體及GAPDH抗體購自CST公司。江灣I-C型立體定向儀（第二軍醫大學器材處），RM6240B型多道生理信號采集處理系統（成都儀器廠），電泳儀及westernblot設備（Bio-Rad公司），不銹鋼雙極同芯電極（自制）。

1.2 實驗動物處理方法 27只SD雄性大鼠，體重160~200 g，來自南陽醫學高等專科學校實驗動物中心。按隨機數字表法將大鼠分為對照組、糖尿病組和肉桂組，每組9只。糖尿病組和肉桂組采用一次性腹腔注射STZ（65 mg/kg），注射用STZ配于0.1 mol/L檸檬酸緩沖液（pH 4.5），對照組注射同劑量的檸檬酸緩沖液。肉桂粉和生理鹽水混合，肉桂組每天按照5 g/kg的劑量通過灌胃添加肉桂粉。28 d后開始斷尾采血進行血糖測試，糖尿病組大鼠空腹血糖水平高于11 mmol/L，之后開始電生理實驗，糖尿病組有2只大鼠在實驗過程中死亡，死亡大鼠數據不列入統計。

1.3 海馬CA1區細胞外電位記錄 電生理測定的方法及參數同文獻[10]，刺激電極置于Schaffer側支，記錄電極在海馬CA1區，單刺激誘導海馬CA1區群體鋒電位（Population spike，PS）。強直刺激誘發LTP。再給予單刺激2 h以上。記錄強直刺激前后CA1區電位波形，用PS幅度作為評測指標，PS增幅=（強直刺激后PS幅度/強直刺激前PS幅度）×100%。

1.4 westernblot蛋白印跡檢測 在電生理測定之后處死動物，取海馬組織在裂解液中冰上裂解，離心機離心10 min（12 000 g，4 ℃），取上清液，通過BCA試劑盒進行蛋白定量測試，使單位樣品蛋白總量保持一致，5%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺（SDS）凝膠電泳，然后轉至硝酸纖維素膜上，于含5%牛血清蛋白（BSA）TBS-T溶液中室溫封閉2 h，含NR2B或GAPDH的抗體的TBS-T溶液（1∶1000）4 ℃孵化過夜，TBS-T溶液洗膜3次，每次10 min，堿性磷酸酶（AP）標記的山羊抗兔抗體中室溫孵化1 h，重復洗膜3次，氯化硝基四氮唑蘭（Nitroblue tetrazolium chloride，NBT）/5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽（5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate，BCIP）顯色液顯色，掃描的圖像用Quantity one 1.0軟件進行灰度值分析，NR2B相對蛋白水平用GAPDH做參照。

圖1 各組強直刺激前后PS幅度變化注：a：各組強直刺激前后PS變化描記圖；b：各組強直刺激前后場電位變化百分數，以強直刺激前30 min PS幅度平均值為100%，在橫坐標上0時進行強直刺激

圖2 各組海馬腦組織中NR2B的表達注：a：NR2B在海馬腦組織中的表達western-blot條帶原始圖例；b：westernblot方法測定NR2B表達量的比值，以對照組平均表達量為1。*與糖尿病組相比，P<0.05

1.5 統計學處理 統計學分析使用SPSS 19.0軟件，Excel軟件用于作圖。所得數據均用（±s）表示，進行單因素方差分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 海馬腦電記錄 單刺激Schaffer側支纖維在25只大鼠海馬CA1區均記錄到幅度穩定的PS，平均幅度為（39.75±4.18）μV。對照組9只大鼠強直刺激后5 min開始觀察到PS幅度增大至強直刺激前平均值的（195.46±3.87）%，最大增幅出現在強直刺激后90 min，為強直刺激前PS平均值的（257.15±3.64）%，這種突觸傳遞效能的增強可維持2 h以上，即誘導出海馬CA1區LTP。強直刺激前后PS幅值的差異有統計學意義（P<0.05）。糖尿病組7只大鼠強直刺激后PS平均增幅為（122.97±2.11）%，明顯低于對照組的平均增幅（235.03±3.84）%（P<0.05），結果顯示糖尿病大鼠海馬CA1區的LTP明顯抑制。肉桂組9只大鼠強直刺激后PS平均增幅為（188.83±3.02）%，明顯高于糖尿病組（P<0.05），強直刺激前后海馬PS變化見圖1。

2.2 海馬NR2B的表達 研究肉桂改變糖尿病大鼠突觸可塑性變化的機制，實驗用westernblot的方法檢測海馬組織中NR2B的表達，如圖2所示，糖尿病組海馬NR2B的表達量明顯下降（P<0.05），平均相對表達量為對照組的60.54%。相對于糖尿病組，肉桂組NR2B的表達量明顯升高（P<0.05），為對照組的84.77%。

3 討論

糖尿病患者的學習記憶功能的下降受到越來越多的關注，以往大量研究表明學習記憶的關鍵部位在海馬，而突觸可塑性變化被認為是海馬參與學習記憶的基本形式[11]。海馬突觸可塑性變化主要包括長時程增強和長時程抑制，自從發現LTP現象以來，由于其具有時程長和聯合的特性，人們認為這種突觸傳遞效能的增強是海馬將短時記憶轉化為長時記憶的生物學基礎。研究表明，阻斷海馬LTP會導致空間學習記憶能力下降，而增強LTP具有促進記憶的功效[12]。晚時相LTP的產生需要腦內信號分子的介導，海馬LTP現象大多與NMDA受體有關，NMDA受體由NR1、NR2和NR3亞基組成，在不同腦區亞基表達不同，成年動物海馬CA1區表達主要為NR2B型亞基，NR2B基因敲除小鼠表現為突觸可塑性和學習記憶功能的下降，而超表達NR2B基因則表現為突觸可塑性和學習記憶能力的增強[13]。有報道稱糖尿病大鼠的認知障礙與NMDA受體有關，應用NMDA受體激動劑可改善糖尿病大鼠的認知障礙[14]。本次實驗中，糖尿病大鼠的海馬CA1區LTP抑制的同時伴有腦內NR2B表達的減少，表明糖尿病導致的突觸可塑性下降與其海馬NR2B表達的抑制有關。

肉桂主要成分為桂皮醛（cinnamaldehyde），占52.92%~61.20%，傳統醫學認為肉桂具有補火助陽、溫里散寒、祛風散寒、溫陽行氣、溫經通脈等功效，近來的研究表明肉桂具有抗氧化、抗糖尿病的作用。有研究稱，肉桂提取物可使糖耐量保持正常并增強機體對胰島素的敏感性，體內實驗和體外實驗均表明肉桂有直接的抗糖尿病的作用[15]。有研究報道肉桂能提高腦組織超氧化物歧化酶活性及神經生長因子、腦源性神經生長因子的表達，降低丙二醛含量，改善慢性腦缺血大鼠的認知能力[16]。本次實驗中，肉桂明顯改善糖尿病大鼠的LTP的抑制現象，提高海馬突觸可塑性，有效改善糖尿病大鼠學習記憶功能的下降，同時，應用肉桂治療后，糖尿病大鼠海馬NR2B的表達增多。這一系列結果表明肉桂改善糖尿病大鼠學習記憶和突觸可塑性與其上調海馬NR2B的表達有關。

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