血清N-乙酰天門冬氨酸與早期神經系統變性疾病的相關性研究*

沈小平 王士列 劉建平 李年春 鄭團圓 劉煜帆

神經變性病（Neurodegenerative Diseases）是指由于神經元變性、凋亡所導致的神經系統退行性疾病，是一組原因不明的中樞系統疾病，他們可能具有相類似的發病機制[1-2]。隨著老齡化日趨嚴重，神經變性疾病的發病率逐漸升高。2007年我國60歲以上人口已達1.49億，其中80歲以上者有1600萬。預計2040年60歲以上的人口將達到3.97億，80歲以上的老人將達到1億。阿爾茨海默病（AD）和帕金森病（PD）是老年人中發病率居于前2位的神經變性疾病，65歲以上AD的患病率為5%，70歲以上為10%，80歲以上則高達30%；65歲以上PD的患病率為1%，隨年齡增加而升高。AD和PD已成為嚴重危害老年人身心健康、增加家庭和社會負擔的神經系統重大疾病。目前這類疾病的早期診斷仍十分困難，可能的手段包括功能影像學、分子遺傳學檢查等，這些檢查設備、技術要求高，難以作為疾病早期篩查手段應用于臨床。N-乙酰天門冬氨酸（N-acetyl aspartic acid，N-AA）是神經系統的特定代謝產物，通常被作為腦內神經元變化的一個標志物。本研究以AD、PD患者及正常老年人作為研究對象，通過檢測其血清NAA含量，并聯合顱腦磁共振波譜（MRS）測定其腦內NAA含量，研究患者血清NAA及腦內NAA的變化是否具有一致性。進一步探討血清NAA與早期神經系統變性疾病的相關性；建立一種簡單、快速、經濟的神經系統變性疾病的篩查手段。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2014年1月-2015年1月住院及門診的AD患者30例，符合2011年美國NIA/AA阿爾茨海默病診斷標準中很可能AD的診斷標準；PD患者30例，符合2006年《中華神經科雜志》發表的中華醫學會神經病學分會運動障礙及帕金森病學組制定的帕金森病的診斷標準。另選擇同時期門診體檢的健康老年人30例。所有入選者均排除有腦白質疏松、腦卒中、腦外傷、腦炎、腫瘤、多發性硬化、偏頭痛、癲癇等各種腦損傷者。三組年齡、性別及受教育年限比較差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。見表1。

表1 三組年齡、性別及受教育年限比較

1.2 方法

1.2.1 血清NAA的測定 取早晨空腹靜脈血5 mL，室溫凝固后收集血清，-80 ℃冰箱保存備用。血清NAA測定采用氣相色譜-質譜聯用儀測定。方法如下：（1）以NAA標準品建立保準曲線。（2）確定氣相色譜質譜條件。（3）精密度試驗：用變異系數（CV）表示精確性。在上述色譜條件下，取低、中、高濃度混合標準品的血清樣本進行批內和批間精密度實驗。（4）回收試驗：取正常空白血清樣品100 μL，分別加入10、100和1000 μg/mL NAA標準品各100 μL，配成低、中、高三種濃度的溶液，采用上述色譜條件進行上機分析。（5）定量下限：當信噪比S/N=10時，測得該方法檢測NAA的定量下限。

1.2.2 腦內NAA檢測 采用1H-MRS檢查。通過常規MRI掃描，應用點解析頻譜序列（point resolved spectroscopy，PRESS）來獲得三維波譜化學位移成像圖（3D-CSI），感興趣區（ROI）為雙內側顳葉及海馬區。自動預掃描程序完成發射或接受增益調節、體素內勻場、水抑制和無水抑制掃描。磁共振掃描儀自帶軟件自動完成基線校準、信號平均，識別并計算各代謝物波峰曲線下面積。不同化合物中原子核的化學位移不同，根據磁共振波譜中其共振峰（化學位移）的位置不同可加以鑒別。化學位移的大小以磁共振頻率的百萬分之一（ppm）表示，MR波譜中以橫坐標來表示，縱坐標代表代謝產物的信號強度單位。與神經系統疾病相關的主要代謝物的化學頻移位置為：N-乙酰天門冬氨酸（NAA）2.01 ppm、肌酸（Cr）3.03 ppm、肌醇（mI）3.56 ppm。并能自動給出以Cr為參照的各種代謝物信號強度的比值（NAA/Cr、NAA/mI）。

1.3 統計學處理 采用SPSS 18.0軟件對數據進行統計分析，計量資料以（x-±s）表示，兩組比較采用t檢驗，三組比較采用方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組雙內側顳葉代謝物濃度的比較 雙內側顳葉NAA的含量為NC組>PD組>AD組，而血清NAA含量剛好相反，代謝物比值NAA/Cr、NAA/mI及血清NAA三組間比較差異均有統計學意義（P<0.05），其中AD組與PD組兩組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.2 三組雙側海馬區代謝物濃度的比較 三組雙側海馬區NAA的含量為NC組>PD組>AD組，而血清NAA含量AD組>PD組>NC組（P<0.05），AD組與PD組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。

表2 三組雙內側顳葉NAA濃度與血清NAA的比較（±s）

表2 三組雙內側顳葉NAA濃度與血清NAA的比較（±s）

*與NC組比較，P<0.05

組別 NAA/Cr（L）NAA/Cr（R）NAA/mI（L）NAA/mI（R）血清NAA NC 組（n=30）2.01±1.01 1.59±0.40 7.80±2.01 6.76±2.12 0.085±0.013 AD 組（n=30）1.28±0.90* 1.68±1.35* 3.91±2.13* 3.78±2.14* 0.102±0.016*PD 組（n=30）1.30±0.80* 1.71±0.92* 4.14±2.12* 3.49±2.08* 0.980±0.012*P值 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05

表3 三組雙側海馬區NAA濃度與血清NAA的比較（±s）

表3 三組雙側海馬區NAA濃度與血清NAA的比較（±s）

*與NC組比較，P<0.05

組別 NAA/Cr（L）NAA/Cr（R）NAA/mI（L）NAA/mI（R）血清NAA NC 組（n=30）1.50±0.40 1.74±0.46 2.80±0.76 2.82±1.08 0.085±0.013 AD 組（n=30）1.06±0.28* 1.23±0.34* 1.16±0.48* 1.48±0.80* 0.102±0.016*PD 組（n=30）1.26±0.30* 1.34±0.42* 1.86±0.82* 1.74±0.78* 0.980±0.012*P值 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05

3 討論

3.1 磁共振波譜分析腦內NAA的濃度變化 近來研究發現神經變性病具有共同特征，各種類型除了受損部位不同之外，組織病理學均顯示神經細胞染色變淡、萎縮、胞體表面不平、細胞核固縮或碎裂、胞漿內虎斑溶解、細胞突減少、突觸水腫或萎縮。神經變性病大多在神經細胞內有包涵體存在，例如，PD和額顳型癡呆的Lewy小體、AD的平野Hirano小體、Pick病時的Pick小體及肌萎縮側索硬化的Bunina小體等包涵體。這些小體形態大致相似，這些小體也都是細胞內各種不同類型蛋白質的異常聚集所致，包括突觸核蛋白、磷酸化tau蛋白、淀粉樣蛋白及泛素化蛋白等。目前已發現神經變性病的發病大多有以下共同因素有關：遺傳基因突變線粒體能量代謝缺陷，活性自由基分子生成過多，興奮性氨基酸釋放過度，鈣離子通道開放和鈣離子內流，以及蛋白質轉錄后修飾異常和神經營養因子供應不足等[3]。本課題研究發現，顱內雙內側顳葉及海馬區AD組和PD組NAA/Cr、NAA/mI均明顯低于NC組，且差異具有統計學意義（P<0.05）。這與AD患者的磁共振波譜變化具有一致性；AD患者出現這種特征性的波譜改變的原因可能有：AD患者腦內老年斑形成與神經原纖維纏結引起NAA的缺乏，同時伴有神經膠質細胞的增生導致mI的過剩；AD患者內側顳葉及海馬等結構，出現神經元的廣泛脫失，引起NAA降低，同時伴有膽堿能、腎上腺能和5-羥色胺能遞質系統障礙，毒蕈堿樣膽堿能受體和α-腎上腺能受體激活時多伴有磷酸肌醇的水解，為了維持受體的功能必須加速肌醇等物質再合成磷脂酰肌醇的過程，因而患者腦內mI水平較高，1H-MRS測量NAA值降低[4-8]。既往學者Schuff等[9]研究發現：利用1H-MRS和MRI研究36~85歲年齡段的24例健康成年人的海馬代謝物及其體積的變化，發現NAA/肌酸（Cr）的比例下降了26%，海馬體積縮小了20%。這表明NAA的水平在正常老年人也有所下降。因此，MRS可通過測定腦組織內多種微量代謝物的含量來分析局部組織代謝的改變，尤其適用于神經系統生化及代謝變化的研究。

3.2 血清NAA與腦內NAA的關系 NAA是神經系統的特定代謝產物，由天門冬氨酸和乙酰輔酶A在神經元線粒體中合成的[10]，是人腦中最集中的神經肽，正常情況下，NAA的清除是從神經元到少突膠質細胞的轉移，當發生病理改變的時候，損傷的神經元中NAA的釋放會增加，此時NAA首先進入星形膠質細胞并進入血液循環[11-13]。本研究發現NC組血清NAA較AD組和PD組患者的血清NAA明顯升高，具有統計學意義（P<0.05），同時也發現血清NAA與腦內NAA呈負相關。Simone等[14]研究發現肌萎縮側索硬化癥（ALS）患者血清NAA的水平明顯高于正常對照者，高水平的NAA與ALS的臨床表現密切相關；也有學者在多發性硬化（MS）患者中，腦NAA的MRS顯示NAA降低，而血清NAA濃度升高[15]，而健康人群中，血清NAA濃度與年齡、性別無顯著相關性[16]。提示腦內神經細胞損害后NAA可能釋放到體液中，所以血清NAA濃度升高可能反映出腦內NAA下降。血清中NAA的測定有可能作為神經變性病患者的一種排除性診斷手段。

對于臨床前期AD、PD患者，他們都是癡呆的高危人群，對這些人群進行早期診斷和干預，有效地遏制或延緩疾病的進展，對社會及患者家庭都具有重大意義。目前，AD等神經變性病早期診斷的研究主要聚焦于顱腦影像學及體液生物學標記，其中血液生物學標記物如血漿B淀粉樣蛋白及其相關抗體、胞外B淀粉樣蛋白分子伴侶等有望用于AD的早期診斷。血液生物標記因樣本獲取簡便，與疾病的病理過程聯系緊密，診斷敏感性及特異性較高，可能成為今后神經變性病的早期生物學標記研究的熱點。

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