骨橋蛋白和E-鈣粘素與宮頸癌放療抵抗的相關性*

錢玉潔，黃昕瓊，申良方

（中南大學湘雅醫院 腫瘤科，湖南 長沙410008）

宮頸癌是世界范圍內女性第三常見的惡性腫瘤[1]，放射治療在宮頸癌的治療中占有重要地位，宮頸癌各期均可行放射治療，包括根治性放療和姑息性放療[2]。然而，放射治療中存在放療抵抗是治療失敗的原因之一。上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是哺乳動物胚胎發育過程中的正常生理現象，但是在成熟組織中發生不恰當的EMT則與腫瘤的浸潤和轉移密切相關。目前的研究表明腫瘤細胞的EMT過程與腫瘤放療抵抗也有相關性。早期研究表明丟失E-鈣粘素（E-cadherin）表達是EMT的顯著特點[3]，近來新證據表明骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）可能參與了EMT過程[4]。目前，尚無研究表明與EMT相關的E-cadherin和Osteopontin蛋白在局部進展期宮頸鱗癌（locally advanced cervical squamous cell carcinoma，LACSCC）中的表達是否與放療敏感性相關。

1 資料與方法

1.1 臨床病例及樣本資料

本回顧性隊列研究共入組132名患者，所有患者均在2005年1月-2012年3月于中南大學湘雅醫院腫瘤放射治療科和湖南省腫瘤醫院接受放射治療。入選標準：①病理學證實為宮頸鱗癌；②診斷時沒有遠處轉移證據（FIGO分期為IB-IVA）；③組織切塊可用于本研究；④放射治療前未接受其他抗腫瘤治療措施且放療后未實施手術者。本研究經過倫理研究委員會批準。隨訪時間至2012年5月，中位隨訪時間為45.0（2.0～85.5）個月。中位無進展生存期（progression free survival，PFS）為43.5（0.0～85.5）個月。中位年齡為51（28～80）歲。132例病例分為放療敏感組（n=85）和放療抵抗組（n=47）。放療敏感組指初始治療后至少3年內無局部復發和遠處轉移，即PFS≥36個月。放療抵抗組指初始治療后3年內出現放療未控制，局部復發或遠處轉移，即PFS<36個月[5]。因此，本研究將放療抵抗組分為3個亞組：放療未控制亞組，局部復發亞組和遠處轉移亞組。放療未控制亞組指腫瘤從未消失直至患者死亡。局部復發亞組指初始治療后3年內出現局部復發。遠處轉移亞組指初始治療后3年內出現遠處轉移。PFS定義為治療結束至第一次證實有局部復發或遠處轉移的時期。如在初始放療后診斷為放療未控制、局部復發或遠處轉移必須有臨床檢查，病理活檢或影像學檢查等證據。每個宮頸腫瘤大小評估均由臨床檢查來直接測量，而不采用影像學手段間接測量。在本研究中，放療未控制亞組9例，局部復發亞組17例，遠處轉移亞組22例。其中1例在放療期間出現遠處轉移，且直至患者死亡腫塊從未消失，筆者認為這1例患者既屬于放療未控制亞組也屬于遠處轉移亞組。另外有3例患者在放療后出現遠處轉移，但該3例患者PFS大于36個月。所以，本研究將這3例患者歸為放療敏感組。

所有患者均接受放射腫瘤醫師制定的外放射治療和高劑量率的腔內放療。外照射開始后的3～4周開始腔內放療。A點中位總劑量為90（66～102）Gy。外照射在A點的中位計量為46（30～52）Gy。腔內放療在A點的中位計量為42（20～54）Gy。其中部分患者同時接受以鉑類為基礎的化療。但化療藥物并不統一，甚至鉑類藥物也不統一，如順鉑、卡鉑和奧沙利鉑等。這些差異增加了統計分析難度。

1.2 免疫組織化學檢測

用免疫組化的方法檢測Osteopontin與E-cadherin，將4μm的組織切片在二甲苯溶液中脫蠟，0.01M檸檬酸緩沖液（pH 6.0）微波處理（Osteopontin孵育10min，E-cadherin孵育15min）。冷卻30min并在磷酸鹽緩沖液中浸泡后，用3%過氧化氫孵育30min以消除內源性過氧物酶活性，接下來在10%常規山羊血清（磷酸鹽緩沖液稀釋）中孵育30min，滴加1∶200比例稀釋的抗Osteopontin（Santa Cruz Biotechnology Inc.，Dallas，TX）抗體和1∶200比例稀釋的抗E-cadherin（Cell Signaling Technology Inc.，Beverly，MA）抗體，4℃過夜。使用ChemMate試劑盒（Dako，Glostrup，Denmark）和3，3-二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒進行染色。為陰性對照，使用非免疫性的同型抗體代替一級抗體。

1.3 染色評價標準

由兩名不知曉臨床特征及預后的病理科醫生對所有樣本進行雙盲法閱片。首先低倍鏡（×40）下觀察全片Osteopontin和E-cadherin表達情況，然后高倍視野（×400）下觀察。采用免疫反應評分（immunoreactivity score，IRS）系統[6]。根據染色細胞比例：0分為無染色，1分為陽性細胞數≤1/3，2分為陽性細胞數>1/3且≤2/3，3分為陽性細胞數>2/3；根據染色強度：0分為陰性，1分為弱陽性，2分為陽性，3分為強陽性。兩項得分之和作為免疫反應得分（0～6）。最終得分為0～1分視為低表達，2～6分視為高表達。

1.4 統計學分析

Osteopontin和E-cadherin表達與宮頸鱗癌臨床病理因素之間的分析，采用卡方檢驗和Fisher's精確檢驗。放療劑量差異采用t檢驗分析。生存分析中截尾值包括隨訪截止及因其他原因而非宮頸鱗癌死亡的患者。采用Kaplan-Meier計算生存曲線，組間差異采用log-rank檢驗。根據Cox比例風險模型進行單因素和多因素分析。回歸模型包括僅表達Osteopontin（高表達與低表達），僅表達E-cadherin（高表達與低表達），高表達Osteopontin同時低表達E-cadherin（是與否），年齡（≥50歲與<50歲），FIGO分期（Ⅲ+ⅣavsⅠb+Ⅱ），組織病理學分級（中分化+低分化與高分化），腫瘤大小（>4 cm vs≤4 cm）。所有統計學檢驗，P≤0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 132例病例的臨床及組織病理學特征

患者的臨床及組織病理學特征見表1。共收集132名LACSCC患者（放療抵抗組47人，放療敏感組85人）。其中<50歲49人，≥50歲83人。FIGO分期為Ⅰb+Ⅱ及Ⅲ+Ⅳa的患者分別為70（6+64）人、62（56+6）人。按照WHO病理分級，高分化、中分化和低分化的人數分別為10、114和8。腫塊最大徑≤4 cm的人數為79人，>4 cm的人數為53人。放療抵抗組與放療敏感組病例之間的腫塊大小、FIGO分期和組織病理學分級差異均有統計學意義，P值分別為0.000、0.004和0.014。兩組之間患者年齡、聯合化療（以鉑類為基礎）、A點總劑量、外照射A點計量和腔內照射A點劑量差異均無統計學意義。

2.2 Osteopontin與E-cadherin的表達與臨床病理學參數的關系

Osteopontin位于宮頸癌細胞胞膜和胞質，其在放療抵抗組的著色較放療敏感組明顯（圖1A和1B）。132例宮頸癌患者中，Osteopontin低表達者65例，占49.2%（65/132），高表達67例，占50.8%（67/132）。分析數據發現Osteopontin的表達與FIGO分期和腫瘤大小顯著相關（P值分別為0.001和0.004），而與患者年齡和病理分級不相關（P值分別為0.963和0.203）。見表2。

E-cadherin位于宮頸癌細胞膜，其在放療敏感組的著色較放療抵抗組明顯（圖1C和1D）。132例宮頸癌患者中，E-cadherin低表達者83例，占62.9%（83/132），高表達者49例，占37.1%（49/132）。分析數據發現E-cadherin的表達與病理分級相關（P=0.039）。而與患者年齡、FIGO分期和腫瘤大小無顯著相關性（P值分別為0.234，0.070和0.626）。

132例患者中，OPN高表達且E-cadherin低表達者為37.9%（50/132），其他表達組合占62.1%和（82/132）。見表2。

分析發現，Osteopontin高表達且E-cadherin低表達與FIGO分期（P=0.000）和腫瘤大小（P=0.030）密切相關。但與患者年齡（P=0.342）和病理分級（P=0.089）不相關。

表1 放射敏感性與臨床病理學特征的關系

表2 宮頸癌組織中Osteopontin與E-cadherin表達與臨床病理學特征的關系

2.3 Osteopontin表達與E-cadherin表達之間的關系

本研究共有132例合格標本為Osteopontin與E-cadherin免疫染色評估。兩種標記物均按照免疫組織化學染色程度分為低、高兩種類型，詳見表3。在Osteopontin高表達的67例病例中，32.8%（22/67）的病例顯示E-cadherin高表達。與此相反的是，Osteopontin低表達的65例病例中，41.5%（27/65）的病例顯示E-cadherin高表達。Osteopontin的表達與E-cadherin的表達無相關性（r=-0.09，P=0.304）。見表3。

表3 OPN與E-cadherin的表達關系

2.4 Osteopontin表達與E-cadherin表達對放療的反應

132例LACSCC標本Osteopontin的表達情況總結見表4。47例放療抵抗組中，6例為Osteopontin低表達，占12.8%（6/47），41例為Osteopontin高表達，占87.2%（41/47）。85例放療敏感組中，59例為Osteopontin低表達，占69.4%（59/85），26例為Osteopontin高表達，占30.6%（26/85）。Osteopontin的高表達率在放療抵抗組與放療敏感組之間的差異具有統計學意義（P=0.000）。根據患者的臨床資料放療抵抗組分為3個亞組：放療未控制亞組，局部復發亞組和遠處轉移亞組。Osteopontin的高表達率在這3個 亞 組 中 的 比 例 分 別 為：88.9%（8/9），88.2%（15/17）和86.4%（19/22）。同樣的，Osteopontin在這3個放療抵抗亞組中的高表達與放療敏感組之間的差異也具有統計學意義（放療未控制組與放療敏感組，P=0.001；局部復發亞組與放療敏感組，P=0.000；遠處轉移亞組與放療敏感組，P=0.000）。

132例宮頸鱗癌標本E-cadherin的表達情況總結見表4。47例放療抵抗組中，E-cadherin低表達有34例，占72.3%（34/47），E-cadherin高表達有13例，占27.7%（13/47）。85例放療敏感組中，49例為E-cadherin低 表 達，占57.6%（49/85），36例 為E-cadherin高表達，占42.4%（36/85）。E-cadherin的低表達率在放療抵抗組與放療敏感組之間的差異無統計學意義（P=0.094）。E-cadherin的低表達率在放療未控制亞組，局部復發亞組，遠處轉移亞組的比例分別為88.9%（8/9）、76.5%（13/17）和77.3%（17/22）。分析3個放療抵抗亞組與放療敏感組中E-cadherin的低表達發現，E-cadherin低表達率在遠處轉移亞組與放療敏感組之間的差異具有統計學意義（P=0.049），而放療未控制亞組及局部復發亞組與放療敏感組之間的E-cadherin表達差異無統計學意義（P值分別為0.084和0.147）。

132例宮頸鱗癌標本Osteopontin與E-cadherin聯合表達情況總結見表4。表達Osteopontin且低表達E-cadherin的病例在放療抵抗組中占72.3%（34/47），在放療敏感組中占18.8%（16/85）。比較放療抵抗組與放療敏感組之間Osteopontin高表達且E-cadherin低表達的情況，發現兩組之間差異具有統計學意義（P=0.000）。在放療抵抗亞組中分析O steopontin高表達且E-cadherin低表達分別為：放療未控制亞組88.9%（8/9），局部復發亞組70.6%（12/17），遠處轉移亞組68.2%（15/22）。3個亞組的Osteopontin高表達且E-cadherin低表達與放療敏感組之間差異有統計學意義（放療未控制亞組與放療敏感組，P=0.000；局部復發亞組與放療敏感組，P=0.000；遠處轉移亞組與放療敏感組，P=0.000）。

2.5 Osteopontin表達和E-cadherin表達與生存的關系

將患者根據腫瘤Osteopontin表達情況進行分層，Osteopontin低表達組（n=65）與高表達組（n=67）的5年無進展生存率分別為88.1%和44.1%。Kaplan-Meier生存分析（log-rank檢驗）發現兩組之間生存差異有統計學意義（P=0.000，圖2A）。

同樣將患者根據腫瘤E-cadherin的表達情況分層，E-cadherin低表達組（n=83）與高表達組（n=49）的5年無進展生存率分別為60.2%和78.3%。Kaplan-Meier生存分析（log-rank檢驗）發現兩組之間生存差異無統計學意義（P=0.097，圖2B）。

表4 宮頸癌組織中osteopontin與E-cadherin表達與放射敏感性的關系

圖1 Osteopontin與E-cadherin在放療抵抗組和放療敏感組中典型的染色圖像（×400）

如果將患者根據腫瘤高表達Osteopontin且低表達E-cadherin分層，那么高表達Osteopontin且低表達E-cadherin病例（n=50）與其他表型病例（n=82）的5年無進展生存率分別為38.1%和81.8%。Kaplan-Meier生存分析（log-rank檢驗）發現高表達Osteopontin同時低表達E-cadherin的患者預后顯著不良（P=0.000，圖2C）。對于所有入組的132例病例，5年無進展生存率為66.8%（圖2D）。

單因素分析發現LACSCC患者的PFS的預測因素包括Osteopontin表達[風險比（95%CI），6.725（3.246，13.936）；P=0.000]，Osteopontin高表達且Ecadherin低表達[風險比（95%CI），5.814（3.144，10.752）；P=0.000]，FIGO分期 [風險比（95%CI），2.610（1.453，4.689）；P=0.001]，及腫瘤大小[風險比（95%CI），3.366（1.885，6.012）；P=0.000]。見表5。

多因素Cox回歸分析發現LACSCC患者的PFS的預測因素包括Osteopontin表達[風險比（95%CI），2.847（1.048，7.730）；P=0.040]，Osteopontin高表達且E-cadherin低 表 達 [風 險 比（95%CI），2.571（1.121，5.894）；P=0.026]，及腫瘤大小[風險比（95%CI），2.635（1.462，4.750）；P=0.001]。見表5。

表5 宮頸癌無進展生存期的單因素COX回歸分析

圖2 LACSCC K-M生存曲線

3 討論

本研究顯示E-cadherin的表達與病理分級相關，而與本試驗涉及的其他臨床病理學因素（年齡、FIGO分期和腫瘤大小）不相關。在YONG等[7]的宮頸癌研究中，E-cadherin與病理分級、淋巴結轉移相關和與臨床分期不相關。同時，YONG等人的研究表明E-cadherin的低表達提示預后不良，但是，本數據顯示，E-cadherin低表達和E-cadherin高表達兩組間的5年無進展生存率并無差異，而且，E-cadherin不是宮頸鱗癌的預后因素。因此，筆者考慮E-cadherin是否在放療抵抗中發揮作用，進而影響預后。

本研究首次做了E-cadherin表達與放療抵抗相關性的研究，發現E-cadherin在放療抵抗組和放療敏感組的表達差異無統計學意義。但在3個放療抵抗亞組中分析E-cadherin的表達情況時，發現遠處轉移亞組和放療敏感組間E-cadherin的低表達率差異具有統計學意義。已有研究證實遠處轉移灶的形成不止與腫瘤細胞發生EMT增加流動性相關，更與其逆過程間質上皮轉化（mesenchymal-epithelial transition，MET）過程相關[3]。因此，筆者推斷，E-cadherin對放射治療的影響主要是因為腫瘤細胞發生了EMT，發生了EMT的腫瘤細胞遷徙到其他組織，逃離輻射作用，再經過MET形成轉移灶，造成最終的放療抵抗。而放射治療區域內的放療失敗，即放療未控制和局部復發與腫瘤細胞E-cadherin表達無關。所以基于本試驗，筆者認為抗腫瘤治療前EMT的水平與放射治療區域內發生的放療抵抗不相關，而與放療抵抗中遠處轉移亞組有關，即治療前EMT高水平提示有更大的可能在放療后3年內出現遠處轉移，表現為放療抵抗。

本研究數據表明，Osteopontin的表達與FIGO分期及腫瘤大小相關，而與患者年齡和病理分級不相關。在胃癌[8]中的研究也顯示Osteopontin表達與臨床分期、淋巴結轉移和遠處轉移相關。目前O steopontin在宮頸癌中的預后提示意義仍有爭議。HAN[9]報道Osteopontin在宮頸癌中高表達與總生存（overall survival，OS；P=0.002）及無疾病生存（disease-free survival，DFS；P=0.033）負相關。JAE[10]的研究則認為Osteopontin在宮頸癌中的表達與生存不相關。本研究結果顯示Osteopontin高表達患者的5年無進展生存率低于Osteopontin低表達患者。并且，Osteopontin高表達是LACSCC患者PFS的獨立不良預后因子。此外，本研究顯示Osteopontin表達與放療反應呈負相關，且Osteopontin在3個放療抵抗亞組分別與放療敏感組間的表達差異均有統計學意義。說明治療前組織Osteopontin高表達提示放療抵抗。關于其具體的機制，目前尚不清楚。由于O steopontin被認為是組織乏氧的內源性標記物[11]及腫瘤放療后再生的指標[12]，筆者推測，宮頸癌組織高表達Osteopontin與放療抵抗有關，部分原因是瘤體乏氧，進而影響放療敏感性，以及放療相關的腫瘤再生。

有研究表明Osteopontin在EMT的起始過程發揮作用[4]，E-cadherin作為EMT發生的標志性表型變化因子，目前缺乏其與Osteopontin表達的關系及兩者聯合異常表達與放療抵抗之間的關系的研究，本研究則填補了這個空白。第一，本研究數據中，O steopontin的表達與E-cadherin的表達并無相關性（r=-0.090，P=0.304）；第二，筆者分析了Osteopontin與E-cadherin聯合表達與放療抵抗的關系，發現O steopontin高表達且E-cadherin低表達提示放療抵抗，并且提示意義較單獨Osteopontin高表達更顯著。這提示聯合檢測腫瘤組織Osteopontin和E-cadherin的表達，有助于評估放療敏感性；第三，高表達O steopontin且低表達E-cadherin的5年無進展生存率低于其他表型。

到目前為止，EMT與放療抵抗之間的關系尚不明確。首先，有研究發現腫瘤細胞發生EMT后不僅表達間質表型特征獲得流動性，還表達某些干細胞表型獲得自我更新能力等干性[13]。因此，筆者認為，治療失敗與腫瘤組織中存在通過EMT獲得干細胞表型的腫瘤細胞有關。其次，Slug、Snail等上皮間質轉化相關轉錄因子（epithelial mesenchymal transition-Transcription factors，EMT-TFs）不僅使腫瘤細胞更具遷徙性和侵入性，還賦予腫瘤細胞輻射抵抗性。Slug突變或Slug敲除鼠表現出放療敏感。因此，認為Slug可以誘導腫瘤細胞發生輻射抵抗[14-16]。研究表明Slug通過活化SCF/kit信號通路[14]，調節DNA損傷修復[15]，抑制輻射后凋亡[16]，使細胞接受致死量輻射后仍可存活。最后，由于腫瘤細胞EMT過程是可逆性的[3]，即發生了EMT的腫瘤細胞遷徙到遠處器官或組織后，可以通過MET重獲增殖能力，發展成為轉移灶。因此，這種動態過程既增加了研究EMT與放療抵抗相關性的困難，同時提示腫瘤細胞發生EMT的可逆性可能與放療抵抗有關。

綜上所述，本研究研究顯示局部進展期宮頸鱗癌高表達Osteopontin、高表達Osteopontin且低表達E-cadherin提示放療抵抗及預后不良，并且，高表達Osteopontin且低表達E-cadherin更具有統計學意義。EMT與腫瘤放療抵抗的關系有待進一步的研究。

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