鴨源高產L-乳酸凝結芽孢桿菌的分離與鑒定

孟長紀，丁 軻，李 旺，李元曉，孫二剛

(1.河南科技大學 宏翔生物飼料實驗室，河南 洛陽 471003；2.河南宏翔生物科技有限公司，河南 汝州 467500；3.河南省動物疫病與公共安全院士工作站，河南 洛陽 471003)

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鴨源高產L-乳酸凝結芽孢桿菌的分離與鑒定

孟長紀1，2，丁 軻1，3，李 旺1，李元曉1，孫二剛2

(1.河南科技大學 宏翔生物飼料實驗室，河南 洛陽 471003；2.河南宏翔生物科技有限公司，河南 汝州 467500；3.河南省動物疫病與公共安全院士工作站，河南 洛陽 471003)

為了獲得高產L-乳酸的凝結芽孢桿菌，從河南省汝州市的肉鴨養殖場采集50份鴨腸道黏液樣品。利用分離培養基對細菌進行分離和純化，用試劑盒檢測L-乳酸產量，結合菌落形態、顯微形態、生理生化試驗和16S rDNA序列鑒定其種屬。鑒定結果表明：從50株細菌中分離得到一株高產L-乳酸的菌株BC07，L-乳酸產量為43.2 g/L。經鑒定為凝結芽孢桿菌，能形成芽孢，而且該菌株能夠耐受較強的酸、膽鹽和高溫。

鴨源；凝結芽孢桿菌；L-乳酸；分離；鑒定

0 引言

乳酸是一種重要的有機酸，其廣泛應用于食品、醫藥、化妝品、煙草等行業，特別是以L-乳酸為原料來生產可降解性塑料—聚乳酸，引起廣泛關注。L-乳酸因其左旋的特征，具有很好的生物相融性，能與哺乳動物相融，可直接參與人體代謝，無任何副作用。與根霉好氧發酵生產L-乳酸相比，乳酸細菌發酵具有對糖轉化率高、無通氣能量消耗、成本低等優點[1]。通常使用的乳酸菌株主要是糞腸球菌、屎腸球菌、乳桿菌等，這些乳酸菌抗逆性差、不耐熱，而在乳酸的生產中，發酵過程中溫度會升高，遠遠超過了生產菌種的最適生長溫度，菌體生長緩慢，產酸量降低，耗糖慢，發酵周期長，影響乳酸生產率，降低經濟效益。與傳統的乳酸菌株相比，凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)發酵生產L-乳酸有很多優點：發酵溫度高，培養基不需要滅菌，生產出的L-乳酸光學純度高等[2]。這些特性符合低能耗、高產出的生產要求。近年來，凝結芽孢桿菌利用磷酸戊糖途徑發酵己糖、戊糖和木糖高效生產L-乳酸而受到廣泛關注[3]。盡管凝結芽孢桿菌發酵生產L-乳酸有諸多優點，但其L-乳酸轉化率和效價比乳酸菌低[4]，所以要想應用到商業生產中，還必須進一步改善凝結芽孢桿菌的L-乳酸轉化率和效價。本試驗旨在從鴨腸道黏液中分離篩選出高產L-乳酸的凝結芽孢桿菌，為研究其最佳L-乳酸轉化率和效價提供菌種支持，同時為L-乳酸的工業化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)樣品：取汝州市河南中宏康馨農業有限公司養殖場50只健康鴨的腸道內壁黏液，編號并保存于4 ℃冰箱備用。

(2)培養基。①分離培養基(改良MRS培養基)：胰蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，酵母粉5 g，葡萄糖5 g，KH2PO42 g，吐溫80 1.0 mL，CaCO320 g，MgSO40.58 g，MnSO40.25 g，α-甲基葡萄糖苷10 g，山梨酸鉀1 g，水1 L，調pH值6.2～6.5。②增殖培養基,即酵母浸出粉胨萄萄糖培養基(yeast extract peptone dextrose medium,YPD):葡萄糖20 g，胰蛋白胨20 g，酵母粉10 g，水1 L，調pH值7.0，115 ℃滅菌20 min。

(3)產酸指示培養基：在增殖培養基的基礎上加入質量分數為0.02%的溴甲酚綠(pH=3.8時呈黃色，pH=5.4時呈藍綠色，pH=4.5時開始有顏色的明顯變化)。

(4)改良礦物質鹽培養基：(NH4)2SO42 g，KH2PO42 g，NaCl 2 g，MgSO40.2 g，MnSO40.05 g，FeSO40.01 g，酵母粉10 g，木糖50 g，CaCO330 g，蒸餾水1 L，自然pH，115 ℃滅菌20 min。

(5)固體培養基:在液體培養基的基礎上添加1.5%～2.0%瓊脂(每100 mL液體培養基中添加1.5～2.0 g的瓊脂)。

(6)L-乳酸檢測試劑盒：購自上海必優生物科技有限公司。

1.2 方法

(1)樣品的采集和處理。從河南康馨農業有限公司養殖場隨機采集50只健康鴨腸道內壁黏液，編號并保存于4 ℃冰箱備用。每份樣品取1 g，分別加入到裝有9 mL生理鹽水(生理鹽水中添加1 g每100 mL的膽酸鈉，然后調節pH 到3.0)的50支試管中[5]，混勻后80 ℃水浴10 min除去雜菌，然后靜置5 min，待用。

(2)菌株的分離和純化。吸取100 μL上清液涂布于分離培養基，置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，待菌落長出后隨機挑取有溶鈣圈的疑似菌落連續進行3次平板劃線。挑取單個菌落，進行革蘭氏染色鏡檢，油鏡下觀察不同菌落的形態，選取符合凝結芽孢桿菌菌株顯微形態的菌株進行產酸檢測。

(3)產酸能力的檢測和L-乳酸產量的檢測。用接種環蘸取菌液，點種在產酸指示培養基上，并做好標記，37 ℃培養24 h后觀察結果。若接種點周圍出現褪色情況，則判定產酸，根據變色圈的大小鑒定產酸能力的強弱。挑選產酸能力較強的菌株進行L-乳酸產量檢測，菌落接種到YPD液體培養基中進行活化，活化后按6%接種量(每100 mL液體培養基中接種6 mL活化好的菌液)接種到裝有250 mL礦物質鹽培養基的250 mL錐形瓶中，50 ℃不攪拌培養48 h。用L-乳酸檢測試劑盒檢測L-乳酸的生成量。

(4)生理生化鑒定。對L-乳酸產量最高的菌株進行生理生化鑒定，參照《伯杰細菌鑒定手冊》[6]和《常見細菌系統鑒定手冊》[7]進行。

(5)16S rDNA鑒定。生理生化鑒定后，進行16S rDNA序列測定[8]。利用Prime Premier 6.0軟件，參考乳酸桿菌的16S rDNA序列為模板設計一對引物：P1:5’-AGAGTTTGA TCCTGG CTCAG-3’，P2:5’-ACGGTTACCTTGTTAC GACTT-3’。利用細菌基因組DNA快速提取試劑盒提取分離菌的全基因組為模板，聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)體系(25 μL)為：12.5 μL PremixTaq( ExTaqVersion 2.0)，模板2 μL，P1、P2各1 μL，加ddH2O至25 μL。PCR擴增程序為：94 ℃，5 min→(94 ℃，50 s→52 ℃，90 s→72 ℃，90 s，30個循環)→72 ℃，10 min→4 ℃，保存。取5 μL PCR產物與2 μL加樣緩沖液混勻，1%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳，80 V電泳30 min，紫外透射儀觀察電泳結果。將PCR產物送至上海生物工程技術服務有限公司測序，然后將16S rDNA序列提交到GenBank進行相似性分析，挑選相似度較高的17個株菌，利用MEGA 5.0軟件進行系統發育樹構建與分析。

2 結果與分析

圖1 菌株顯微形態圖

2.1 菌株的分離純化結果

經過改良MRS培養基初步分離，分離菌株有的呈球狀，有的呈桿狀，桿狀菌株的營養體有的呈鏈狀排列，有的成對，有的單個存在。當過營養培養形成芽孢后可見芽孢有的中生，有的端生，且末端膨大，有的呈空殼狀。對每個菌株進行革蘭氏染色并鏡檢，其中疑似菌株BC01顯微形態見圖1a，疑似菌株BC07顯微形態見圖1b。

2.2 菌株產酸及L-乳酸產量檢測結果

將21株菌接種到產酸培養基平板上，置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，發現有12個平板上出現褪色圈，褪色圈直徑D見表1。

表1 褪色圈直徑和L-乳酸產量

注：D為褪色圈直徑，M為L-乳酸產量。

將菌株分別接種到裝有250 mL改良礦物質鹽培養基的250 mL錐形瓶中，不攪拌培養48 h，L-乳酸的產量M見表1。其中，菌株BC07的L-乳酸產量最高，所以選擇菌株BC07進行鑒定。

2.3 菌株生理生化鑒定結果

圖2 16S rDNA片段PCR擴增結果

生理生化鑒定結果顯示:菌株BC07是革蘭氏陽性菌，能運動，厭氧、55 ℃、pH5.0均能生長，能發酵戊糖、蔗糖、棉子糖、海藻糖、阿拉伯糖，能水解酪蛋白，不能水解明膠，甲基紅、卵黃反應、丙酸鹽、檸檬酸鹽試驗呈陰性。參考《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊》，初步鑒定BC07屬于芽孢桿菌屬。

2.4 菌株16S rDNA鑒定結果

以菌株BC07基因組DNA為模板，PCR擴增后在1%(質量分數)的瓊脂糖凝膠上電泳，結果如圖2所示。圖2中，在約1 400 bp處出現明亮條帶，與預期結果一致。

PCR產物測序結果顯示菌株BC07的16S rDNA序列長度為1 402 bp，GenBank中的登錄號為KR135825。從GenBank中挑選相似度高的17株芽孢桿菌屬菌株，利用MEGA 5.0軟件構建系統發育樹，結果見圖3。由圖3可知：分離菌株BC07與凝結芽孢桿菌BacilluscoagulansIAM 12463親緣關系最近，所以確定菌株BC07為凝結芽孢桿菌。

圖3 基于16S rDNA序列構建菌株BC07的系統發育樹

3 討論

本試驗分離菌株時是將樣品加入到pH3.0且含有1%(質量分數)膽酸鹽的生理鹽水中，這一步可殺死樣品中不耐酸和不耐膽鹽的雜菌，再將樣品80 ℃水浴10 min，除去不耐熱的雜菌。這種方法處理后，減少了雜菌的干擾。菌株的鑒定是以分子鑒定(16S rDNA序列測定)為主，生理生化鑒定為輔，分子鑒定后加以進化樹分析，得出的結果準確可靠。分離出的凝結芽孢桿菌比乳酸菌有很大優勢，其產生的芽孢易儲存、耐高溫、發酵產乳酸，可有效降低發酵成本。凝結芽孢桿菌可以利用乳酸菌難以利用的原料來發酵生產乳酸，文獻[9]分離出的凝結芽孢桿菌IP E22表現出很強的發酵戊糖、己糖和纖維素二糖的能力，也能耐受木質纖維素水解產生的抑制劑，可以從小麥秸稈中發酵生產乳酸。分離出的凝結芽孢桿菌BC07，L-乳酸產量在分離菌株中最高，但相比一些乳酸菌的L-乳酸產量，菌株BC07的乳酸產量還需進一步提高。通過優化發酵生產過程，控制代謝流量，在L-乳酸的工業化生產上，該菌株將很有潛力。

分離出的凝結芽孢桿菌除能應用到生產L-乳酸外，還能作為微生態制劑添加到動物飼料中。與從糞便和土壤中分離相比較，從健康鴨腸道黏膜分離出的凝結芽孢桿菌，具有更好的腸道定植能力。應用到飼料、獸藥中，動物食用后能很好地在腸道定植，適應腸道內的環境，有利于更好地發揮其益生作用。凝結芽孢桿菌進入腸道后能調節腸道內微生態的菌群平衡，提高機體免疫和抗病能力，減少腸道疾病的發生。在腸道內定植后會分泌淀粉酶和蛋白酶，促進飼料的消化吸收，降低料肉比。產生的乳酸、抗菌凝固素及多種酶能抑制有害菌的繁殖，有通便、止瀉作用，還可改善動物機體的免疫功能，提高抗病力[10]。文獻[11]研究發現：凝結芽孢桿菌制劑能提高肉鴨平均日增質量，降低飼料質量與體質量比，提高血清中谷胱甘肽過氧化氫酶活性，同時還能提高其免疫器官指數。而且凝結芽孢桿菌作為益生菌無任何毒副作用，使用安全，在代謝過程中還能產生抑菌物質—凝結素，對胃腸道炎癥有一定的治療作用。文獻[12]研究發現：凝結芽孢桿菌活菌片改善腹瀉患兒的臨床癥狀，同時也縮短了病程。可見，凝結芽孢桿菌既可用在畜禽養殖中發揮益生作用，也可用在臨床上緩解胃腸道疾病。

4 結論

本試驗從健康鴨腸道黏液中分離出一株芽孢桿菌BC07，該菌株高產L-乳酸，耐高溫、耐酸、耐膽鹽，經形態學觀察、產酸檢測、產L-乳酸檢測、生理生化鑒定、16S rDNA測序鑒定為凝結芽孢桿菌。

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河南省科技廳重大科技攻關基金項目(131100110300);河南省教育廳科學技術研究重點基金項目(13B230987)

孟長紀(1991-),男,河南確山人,碩士生;丁軻(1977-),男,通信作者,河南永城人,副教授,博士,碩士生導師,主要從事動物微生態學方面的研究.

2015-05-07

1672-6871(2015)06-0067-04

S816.7

A