槲皮素通過自噬途徑減輕高糖致體外培養RSC96細胞的損傷

屈嶺 梁曉春 顧蓓 張宏 石玥

糖尿病周圍神經病變發病機制尚未闡明，尚缺乏有效治療手段［1-2］。槲皮素廣泛存在于多種中藥和食物中，具有抗氧化、清除自由基等作用。有學者發現槲皮素可增加被高濃度葡萄糖所抑制的神經細胞的增殖活性，減少氧化應激損傷，并可通過誘導自噬而減少凋亡［3-5］。本研究通過離體實驗觀察了槲皮素對高濃度葡萄糖培養雪旺細胞中增殖活性、凋亡與自噬變化規律的影響，來了解槲皮素是否通過自噬—凋亡途徑對糖尿病周圍神經病變起到防治作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞 大鼠雪旺細胞系細胞(rat Schwann cell line，RSC96)，一種永生化的大鼠雪旺細胞，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.1.2 藥品試劑 槲皮素、噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、3-甲基嘌呤(3-methyladenine，3-MA)(Sigma，美國);改良Eagle培養基(Dulbecco's modification of Eagle's medium，DMEM)(Gibco，美國);兔抗大鼠caspase-3 多克隆抗體、兔抗大鼠caspase-9 多克隆抗體(Santa Cruz，美國);原位末端標記法(terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)試劑盒(Roche，美國)。

1.1.3 實驗儀器 CO2培養箱(Forma 3111，美國);高速低溫離心機(ALC PK121R，美國);倒置相差顯微鏡(Olympus CKX31SF，日本);激光掃描共聚焦顯微鏡(LEⅠCA TCS SP2SE，德國);透射電子顯微鏡(JEM 1010，日本)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 復蘇RSC96 細胞，加入DMEM培養基、胎牛血清(10%)、谷氨酰胺(終濃度4 mmol/L)、丙酮酸鈉(終濃度1 mmol/L)、HEPES(終濃度12.5 mmol/L)，2 ～3 天換液1 次。

1.2.2 TUNEL 檢測 作用72 小時后，4%多聚甲醛固定樣本1 小時(室溫下);0.1%TritionX-100 孵育3 分鐘;陽性對照組:滴加脫氧核糖核酸酶Ⅰ后，室溫下孵育10 分鐘，滴加TUNEL 反應液，陰性對照組滴加試劑2，避光，37℃，濕盒中孵育60 分鐘;滴加轉換劑50 μL，37℃，濕盒中孵育30 分鐘，滴加顯色劑，1 ～2 分鐘，滴加蘇木素染色，鹽酸酒精分化液分化，封片。各組在×400 倍視野下，隨機選取10個視野。應用ⅠPP 6.0 軟件計算凋亡細胞占有核細胞的百分比。重復2 次。

1.2.3 MTT 比色法 加入不同條件72 小時后檢測。取96 孔板，棄培養基，加入10% MTT 200 μL/孔于37℃孵育2 ～4 小時后，吸出培養液，加入二甲基亞砜200 μL/孔，室溫靜置30 分鐘至1 小時于酶標分析儀檢測吸光度(optical density，OD)值，檢測波長570 nm。每次重復5 孔，重復3 次。

1.2.4 Western Blot 加入不同條件72 小時后檢測。各組細胞標本加入裂解液進行勻漿，離心取上清液，測定蛋白濃度，將含有50 μg 蛋白的上清液用電泳分離，并轉移到硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的TBS-T 中和硝酸纖維素膜降低非特異性結合。一抗孵育，沖洗后再用二抗孵育，采用ECL 試劑盒檢測。條帶用Gel-Pro 圖像分析系統掃描定量。重復3 次。

1.3 統計學處理

數據錄入和處理均采用SPSS 19.0 統計軟件包，分析前采用One Sample Kolmoglrov-Smirnov Z test 檢驗數據是否符合正態分布，符合正態分布的數據采用均數±標準差(±s)描述，多組獨立樣本比較采用單因素方差分析，細胞增殖活性OD 值方差齊，采用Bonferroni 法，凋亡率、P35/β-actin、P20/β-actin 及Beclin1/β-actin 方差不齊，采用Dunnett's T3 法。各種檢驗的顯著性水平設定為P ＜0.05。

2 結果

2.1 高濃度葡萄糖抑制RSC96 細胞增殖活性

在培養基中加入不同濃度的葡萄糖，分為正常對照(Con)組、G50 組(葡萄糖終濃度為50 mmol/L)、G75 組(葡萄糖終濃度為75 mmol/L)、G100 組(葡萄糖終濃度為100 mmol/L)及G125 組(葡萄糖終濃度為125 mmol/L)。各組OD 值隨著時間延長而升高。72 小時后檢測，G100 組與G125 組OD 值較Con 組明顯降低(P ＜0.05，P ＜0.01)。提示高濃度葡萄糖可抑制RSC96 細胞增殖活性，見表1。

表1 不同時間不同濃度葡萄糖對OD 值的影響(±s)

表1 不同時間不同濃度葡萄糖對OD 值的影響(±s)

注:與Con 組比較，aP ＜0.05，bP ＜0.01。

組別0h 6h 24h 48h 72h Con 0.109 ±0.009 0.107 ±0.008 0.254 ±0.073 0.369 ±0.052 0.934 ±0.078 G50 0.112 ±0.010 0.109 ±0.008 0.268 ±0.070 0.360 ±0.035 0.906 ±0.049 G75 0.110 ±0.005 0.103 ±0.007 0.290 ±0.049 0.366 ±0.022 0.915 ±0.051 G100 0.109 ±0.006 0.098 ±0.010 0.295 ±0.015 0.327 ±0.029 0.835 ±0.040a G125 0.117 ±0.012 0.108 ±0.014 0.295 ±0.047 0.323 ±0.011 0.776 ±0.073 b

2.2 槲皮素減輕高糖對RSC96 細胞增殖活性的抑制

在終濃度125 mmol/L 的葡萄糖培養基中加入不同濃度的槲皮素。實驗分為Con 組、高糖(Glu)組、Q10 組(Que 終濃度10 μmol/L)、Q25 組(Que 終濃度25 μmol/L)、Q50 組(Que 終濃度50 μmol/L)、Q100 組(Que 終濃度100 μmol/L)及Q200 組(Que 終濃度200 μmol/L)。作用72 小時后，各治療組OD 值均較Con組降低，除Q10 及Q25 組外，均具有統計學意義(P ＜0.01);Q10 及Q25 組與與Con 組無明顯差異(P＞0.05)。Q10 與Q25 組OD 值較Glu 組明顯升高(P ＜0.01)，Q100 與Q200 組OD 值較Glu 組顯著降低(P＜0.01)，Q50 組與Glu 組之間比較無明顯差異(P＞0.05，表2)。提示槲皮素對高糖培養的RSC96 細胞的增殖活性呈雙向調節作用。低濃度槲皮素可促進高糖培養RSC96 細胞的增殖活性，而高濃度槲皮素則抑制高糖培養RSC96 細胞的增殖活性。

表2 不同濃度槲皮素對高糖培養RSC96 細胞OD 值的影響(±s)

表2 不同濃度槲皮素對高糖培養RSC96 細胞OD 值的影響(±s)

注:與Glu 組比較aP ＜0.01;與Con 組比較bP ＜0.01。

組別 OD值Con 0.983 ±0.133 a Glu 0.560 ±0.06b Q10 0.828 ±0.080a Q25 0.821 ±0.069a Q50 0.551 ±0.199b Q100 0.168 ±0.02ab Q200 0.083 ±0.005 ab

2.3 低濃度槲皮素減少高濃度葡萄糖所致RSC96細胞的凋亡

結果顯示Glu 組凋亡率較Con 組明顯升高(P ＜0.01)，Que 組(終濃度25 μmol/L)較Glu 組明顯減少(P ＜0.01)，與Con 組比較無明顯差異(P＞0.05，圖1A、表3)。進一步通過Western blot 法檢測caspase-9 活化的P35 亞基和caspase-3 活化的P20亞基的表達(圖1B，表3)。結果Glu 組P35 亞基表達較Con 組明顯增加(P ＜0.01);Que 組活化的P35亞基表達較Glu 組減少(P ＜0.05)，與Con 組比較無統計學差異(P＞0.05)。Glu 組P20 亞基表達較Con組增加(P ＜0.01)，Que 組P20 亞基表達較Glu 組減少(P ＜0.01)，與Con 組比較無統計學差異(P＞0.05)。提示低濃度槲皮素可減少高濃度葡萄糖所致RSC96 細胞的凋亡。

圖1 槲皮素對高糖培養RSC96 凋亡的影響

表3 槲皮素對高糖培養RSC96 凋亡的影響(±s)

表3 槲皮素對高糖培養RSC96 凋亡的影響(±s)

注:與Glu 組比較，aP ＜0.05，bP ＜0.01。

組別 凋亡率(%) P35/β-actin P20/β-actin Con 8.45 ±3.88b 0.13 ±0.02b 0.09 ±0.06 b Glu 23.61 ±7.57 1.40 ±0.19 0.35 ±0.08 Que 10.99 ±4.03b 0.73 ±0.37a 0.04 ±0.04 b

2.4 抑制自噬削弱槲皮素對高糖培養RSC96 細胞增殖的促進作用

加入自噬抑制劑3-MA，其中M0 組(不加入3-MA)、M1 組(3-MA 終濃度1 mmol/L)、M2 組(3-MA終濃度2 mmol/L)、M5 組(3-MA 終濃度5 mmol/L)及M10 組(3-MA 終濃度10 mmol/L)。作用72 小時后以MTT 法檢測細胞增殖活性。結果顯示，與各組未加3-MA 時比較，除了加入1 mmol/L 的3-MA 外，隨著3-MA 濃度的提高，各組OD 值明顯降低(P ＜0.01)。當加入1 mmol/L 的3-MA 時，Glu 組和Que組OD 值均較Con 組明顯減低(P ＜0.01)，而Que 組和Glu 組相比較，兩組OD 值無明顯差異(P＞0.05)。當加入2 mmol/L 及以上濃度的3-MA 時，三組間OD 值比較均無明顯差異(P＞0.05)。抑制自噬后槲皮素促進高糖培養RSC96 細胞增殖活性的保護作用隨之消失，提示槲皮素的促增殖作用與自噬途徑相關，見表4。

表4 自噬對高糖培養RSC96 增殖的影響(OD，±s)

表4 自噬對高糖培養RSC96 增殖的影響(OD，±s)

注:與相同3-MA 濃度條件下的Glu 組比較，aP ＜0.01;與相同3-MA 濃度條件下的Con 組比較，bP ＜0.01;與各自組未加入3-MA 時比較，cP ＜0.01。

組別Con Glu Que M0 0.983 ±0.133a 0.560 ±0.062b 0.821 ±0.069 ab M1 0.800 ±0.097 0.619 ±0.071b 0.557 ±0.118bc M2 0.332 ±0.061c 0.329 ±0.025c 0.370 ±0.060c M5 0.115 ±0.009c 0.116 ±0.015c 0.097 ±0.011c M10 0.100 ±0.018c 0.092 ±0.012c 0.089 ±0.010 c

2.5 抑制自噬削弱槲皮素減少高糖培養RSC96 細胞凋亡的作用

加入10 mmol/L 的3-MA 后光學顯微鏡可見各組RSC96 細胞數量均明顯減少，胞體腫脹明顯，所剩細胞胞核多呈染色陽性表現;半定量分析，各組間凋亡率比較無明顯差異(P＞0.05，圖2A，表5)。加入1 mmol/L 的3-MA 后，自噬相關蛋白Beclin1、P35 亞基和P20 亞基的表達在三組間比較無明顯差異(P＞0.05，圖2B，表5)。提示槲皮素減輕高糖培養RSC96 細胞凋亡的作用可能與自噬有關。

圖2 自噬對高糖培養RSC96 凋亡的影響

表5 自噬對高糖培養RSC96 凋亡的影響(±s)

表5 自噬對高糖培養RSC96 凋亡的影響(±s)

組別 凋亡率(%) P35/β-actin P20/β-actin Beclin1/β-actin Con 25.35 ±20.61 0.07 ±0.08 0.53 ±0.31 0.07 ±0.04 Glu 46.78 ±37.62 0.06 ±0.07 0.83 ±0.57 0.03 ±0.01 Que 39.97 ±30.98 0.06 ±0.07 0.71 ±0.45 0.02 ±0.01

3 討論

槲皮素廣泛存在于中藥和食物中，具有抗氧化應激損傷、抗癌、抗炎、降糖、降壓、免疫調節等多種保護作用。糖尿病周圍神經病變尚缺乏有效治療手段，有學者發現槲皮素可減少高濃度葡萄糖對神經細胞增殖活性的抑制，減少氧化應激損傷，并可通過誘導自噬而減少凋亡［3-5］。本研究通過離體培養RSC96 細胞作為模型進一步探討槲皮素在高濃度葡萄糖致雪旺細胞損傷中的保護作用機制。

本實驗首先采用MTT 法檢測細胞增殖活性，結果發現隨著葡萄糖濃度的提高，RSC96 細胞增殖活性降低。此與既往在高濃度葡萄糖環境下原代培養雪旺細胞的研究結果相似［6-8］，進而檢測了不同濃度的槲皮素對高濃葡萄糖培養的RSC96 細胞增殖活性的影響，結果提示槲皮素對細胞增殖活性具有雙向作用，即低濃度的槲皮素可減輕高濃度葡萄糖對雪旺細胞增殖活性的抑制作用;與之相反，高濃度的槲皮素則加劇了高濃度葡萄糖對雪旺細胞增殖活性的抑制作用。

高濃度葡萄糖對雪旺細胞的損傷作用還體現在增加原代培養雪旺細胞的凋亡方面［6，9-11］，有文獻報道槲皮素可通過誘導自噬而減少凋亡［3-5］。因此，本研究觀察了低濃度槲皮素對高糖環境下RSC96 細胞凋亡的影響，結果表明高濃度葡萄糖可增加細胞凋亡，低濃度槲皮素則可減少高糖條件下細胞的凋亡。

Beclin1 基因也稱becn1 基因，參與自噬體形成的啟動過程，可對細胞自噬活性進行動態監測和判斷［12］。3-甲基腺嘌呤(3-MA)是目前最常用的自噬抑制劑［13］。筆者發現加入3-MA 后各組RSC96 細胞增殖活性降低，槲皮素改善高糖培養細胞增殖的作用消失。同時，當自噬被抑制后各組細胞數量稀少，細胞死亡增多，槲皮素抗凋亡的作用也隨之消失。以上結果不但提示低濃度槲皮素緩解高糖培養致RSC96 細胞增殖活性減低的作用可能與自噬途徑有關，而且表明自噬途徑可能也參與了低濃度槲皮素抗凋亡的調節。

綜上筆者認為，槲皮素可能通過自噬途徑增加高糖培養雪旺細胞的增殖活性、減少細胞凋亡。但是現有研究尚不能完全揭示自噬的分子機制、信號轉導途徑及其在高糖毒性中具體的病理生理學作用。在今后的工作中可進一步通過在體研究印證自噬對糖尿病周圍神經病變的影響及槲皮素的保護作用。

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