芍甘附子湯加味對膠原誘導性關節炎大鼠滑膜血管新生相關因子表達的影響

柳洋 朱躍蘭 侯秀娟 劉小平

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種累及全身多關節、以慢性滑膜炎和血管翳形成為主要病理改變的自身免疫性疾病。廣泛的新生血管網的形成是維持血管翳生長、關節軟骨和骨組織遭受侵蝕和破壞的病理基礎。血管新生是由多分子機制參與形成的過程，其中缺氧誘導因子(hypoxiainducible factor，HⅠF)—血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)—血管生成素(angiopoietin，ANG)軸［1］起著重要作用。筆者團隊前期研究表明芍甘附子湯可能通過降低膠原誘導性關節炎(CⅠA)大鼠滑膜VEGF 及其受體VEGFR 的表達起到抑制血管新生的作用［2］。本實驗擬通過進一步觀察CⅠA 大鼠滑膜組織中HⅠF-1α、Ang-1 和Ang-2的表達，探討它們在滑膜血管新生中的作用機制，為臨床治療RA 提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級健康Wistar 大鼠30 只，雌性，體質量(110 ±10)g，鼠齡6 ～8 周，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號:SCXK(京)2012-0001，適應性飼養1 周。

1.2 實驗藥物

芍甘附子湯加味(方藥組成:黑順片15 g、白芍15 g、甘草10 g、雞血藤15 g、青風藤15 g、牛膝15 g)，購自北京同仁堂，由北京中醫藥大學東方醫院中藥房煎制;雷公藤多甙片(湖南千金協力藥業有限公司，生產批號:Z43020138，10 mg/片)。芍甘附子湯加味和雷公藤多甙片按照成人用量的7 倍來計算大鼠用量。

1.3 試劑和儀器

牛Ⅱ型膠原購自美國Chondrex 公司，批號20022;完全弗氏佐劑購自美國Sigma 公司，批號SLBC5083;HⅠF-1α 抗體購自美國Abcam 公司，批號ab8366;Ang-1、Ang-2 抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司，批號bs-0800R、bs-0677R;酶標儀購自美國Thermo 公司，型號MK3;足趾容積測量儀購自濟南益延科技發展有限公司，型號YLS-7B;德國ⅠKA 高速分散機，型號T10 basic ULTRA-TURRAX。

1.4 制備模型

參照文獻［3］的方法，制備CⅠA 模型。將10 mg牛Ⅱ型膠原溶解于0.1 mol/L 乙酸，此溶液與等量的完全弗氏佐劑溶液混合，制備成終濃度為1 mg/mL的混合物，并使混合物充分乳化。取此乳化劑于大鼠左足底及尾根部進行多點皮內注射，每只0.2 mL，壓迫注射部位使乳化物完全吸收，7 天后如同法加強免疫1 次。

1.5 動物分組及給藥

將動物隨機分出5 只為正常組，常規飼養，其余均如上法制備CⅠA 模型。造模成功后，將其隨機分為:模型組、對照組及小、中、大劑量治療組，每組各5 只。于第二天開始給藥干預，正常組和模型組均給予蒸餾水灌胃，對照組給予雷公藤多甙片(8.75 mg/kg·d)灌胃，治療組則分別給予小、中、大劑量(0.708、1.42、2.83 g/kg·d)芍甘附子湯加味灌胃，每天1 次，連續4 周。

1.6 一般情況觀察

觀察各組大鼠的精神狀態、毛發、食水量及活動情況，于每周固定時間測定體質量變化。

1.7 足趾腫脹體積測定及關節炎指數(AⅠ)評分

采用足趾容積測量儀測量各組大鼠雙后足踝關節的體積，并觀察關節腫脹度變化。關節病變以按級評分法評價，根據四肢各肢體病變程度累計積分，計算出AⅠ。0 分:無紅腫;1 分:1 個趾關節紅腫;2 分:2 個及2 個以上趾關節紅腫;3 分:踝關節以下足爪紅腫和足趾腫脹，4 分:全足爪嚴重腫脹且不能負重。各關節積分累積即每只大鼠的AⅠ，最高分為16 分。

1.8 免疫組化法檢測HⅠF-1α、Ang-1 和Ang-2 表達

用10%水合氯醛對大鼠進行腹腔麻醉，腹主動脈取血后取膝關節，保留完整滑膜組織，放入4%多聚甲醛固定24 小時，10%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液脫鈣，常規石蠟包埋切片，行免疫組化染色。HⅠF-1α 陽性結果為滑膜組織細胞漿染成棕黃色，Ang-1和Ang-2 陽性結果為滑膜組織細胞漿呈棕黃色或棕褐色，少量表達于細胞核。每張切片隨機觀察5 個視野，輸入Mias 圖像分析管理系統4.0 進行分析，計算陽性細胞的平均光密度值(OD 值)。

1.9 統計方法

所有數據采用SPSS 17.0 軟件進行統計分析，以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，足趾腫脹體積、HⅠF-1α、Ang-1、Ang-2 的表達和AⅠ28 方差齊，其兩兩比較用One-way ANOVA 的LSD 法，AⅠ14、AⅠ42 和AⅠ56方差不齊，采用Mann-Whitney 檢驗。以P ＜0.05 為有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

正常組大鼠狀態良好，反應敏捷，行動迅速，毛發濃密有光澤，食欲較好，體質量穩定增長。模型組大鼠則出現精神變差、食欲下降、行動遲緩、體質量增長緩慢等改變。后逐漸出現四肢紅腫，皮膚充血，局部皮膚破潰，雙后肢難以負重，關節明顯變形。藥物干預大鼠與模型組大鼠相比，關節炎癥狀均有不同程度減輕，腫脹逐漸消退，原充血皮膚出現皺縮，破潰處結痂或愈合，精神狀態亦有所好轉。

2.2 足趾腫脹體積和AⅠ變化

與正常組比較，造模第5 天開始出現輕度炎癥表現，左足皮膚發紅，輕微腫脹。造模第14 天和第28 天，所有造模大鼠均表現出明顯炎癥反應并呈逐漸加重趨勢，足趾腫脹體積和AⅠ評分升高(P ＜0.01)。模型建立成功后即開始給予藥物治療。與模型組比較，造模第42 天，對照組和大劑量治療組足趾腫脹體積有所降低(P ＜0.05)，對照組和中、大劑量治療組AⅠ評分明顯降低(P ＜0.01);第56 天，對照組和大劑量治療組足趾腫脹體積明顯降低(P＜0.01)，對照組和中、大劑量治療組AⅠ評分明顯降低(P ＜0.01)。見表1、2。

表1 芍甘附子湯加味對CⅠA 大鼠足趾腫脹體積的影響(±s，n=5，mm)

表1 芍甘附子湯加味對CⅠA 大鼠足趾腫脹體積的影響(±s，n=5，mm)

注:與正常組比較aP ＜0.01;與模型組比較bP ＜0.05 cP ＜0.01

組別 第14 天 第28 天 第42 天 第56天正常組 1.535 ±0.076 1.547 ±0.046 1.601 ±0.039 1.612 ±0.031模型組 3.094 ±0.532a 3.131 ±0.328a 3.085 ±0.321 2.960 ±0.281對照組 3.071 ±0.326a 3.086 ±0.205a 2.639 ±0.327b 2.352 ±0.320c小劑量組 3.001 ±0.248a 3.031 ±0.217a 2.887 ±0.232 2.777 ±0.287中劑量組 3.045 ±0.176a 3.101 ±0.194a 2.770 ±0.284 2.535 ±0.355b大劑量組 3.113 ±0.209a 3.195 ±0.281a 2.733 ±0.275b 2.402 ±0.322 c

2.3 各組大鼠滑膜組織HⅠF-1α、Ang-1 和Ang-2 的表達變化

與正常組比較，模型組HⅠF-1α 和Ang-1 表達均顯著增加(P ＜0.01)，Ang-2 表達增加(P ＜0.05);與模型組比較，對照組和大、中劑量治療組HⅠF-1α和Ang-1 表達均出現顯著減少(P ＜0.01)，與對照組比較，小劑量治療組HⅠF-1α 和Ang-1 表達明顯增加(P ＜0.01)，中、大劑量組差異無統計學意義;而中、大劑量治療組HⅠF-1α 相較于小劑量組的表達則有所降低(P ＜0.05);Ang-2 表達呈減少趨勢，但各組間差異無統計學意義。HⅠF-1α、Ang-1 和Ang-2免疫組化染色結果分別見圖1、2、3;平均光密度值及各組間比較見表3。

表2 芍甘附子湯加味對CⅠA 大鼠AⅠ評分的影響(±s)，n=5，分)

表2 芍甘附子湯加味對CⅠA 大鼠AⅠ評分的影響(±s)，n=5，分)

注:與正常組比較aP ＜0.01;與模型組比較bP ＜0.05 cP ＜0.01

組別 第14 天 第28 天 第42 天 第56天正常組0 0 0 0模型組 4.70 ±0.97a 8.80 ±1.30a 7.60 ±0.55 6.60 ±0.89對照組 4.30 ±0.97a 8.80 ±1.48a 5.00 ±1.00c 2.40 ±1.52c小劑量組 4.60 ±0.89a 8.40 ±1.82a 6.00 ±0.71b 4.20 ±1.30b中劑量組 4.40 ±1.14a 8.40 ±1.14a 5.20 ±0.84c 3.00 ±0.71c大劑量組 4.60 ±0.96a 8.60 ±1.52a 4.80 ±1.30c 2.60 ±0.89 c

表3 芍甘附子湯加味對CⅠA 大鼠滑膜組織HⅠF-1α、Ang-1 和Ang-2 表達的影響(±s，n=5)

表3 芍甘附子湯加味對CⅠA 大鼠滑膜組織HⅠF-1α、Ang-1 和Ang-2 表達的影響(±s，n=5)

注:與正常組比較aP ＜0.05 bP ＜0.01;與模型組比較cP ＜0.01;與對照組比較dP ＜0.01;與小劑量組比較eP ＜0.05

組別 HⅠF-1α Ang-1 Ang-2正常組0.438 ±0.039 0.444 ±0.038 0.446 ±0.054模型組 0.528 ±0.023b 0.522 ±0.015b 0.494 ±0.021a對照組 0.456 ±0.011c 0.460 ±0.019c 0.452 ±0.043小劑量組 0.510 ±0.020d 0.502 ±0.015d 0.492 ±0.036中劑量組 0.478 ±0.015ce 0.484 ±0.011c 0.488 ±0.028大劑量組 0.474 ±0.017ce 0.476 ±0.017c 0.476 ±0.024

3 討論

圖1 各組大鼠膝關節滑膜組織HⅠF-1α免疫組化染色結果(×200)

圖2 各組大鼠膝關節滑膜組織Ang-1免疫組化染色結果(×200)

圖3 各組大鼠膝關節滑膜組織Ang-2免疫組化染色結果(×200)

RA 是一種以慢性滑膜炎為特征的自身免疫性疾病，其主要病理學表現為滑膜組織增厚、滑膜細胞增生和炎癥細胞浸潤等，導致血管翳的形成，進一步侵蝕和破壞骨結構和關節軟骨，最終造成不可逆的關節畸形和功能障礙。近年來諸多研究發現，血管新生在RA 的病理過程中具有關鍵性的作用，在疾病的早期便開始作用并貫穿整個病程，它是在原有的毛細血管基礎上通過血管內皮細胞的增殖和遷移，從先前存在的血管處衍生出的新的毛細血管，是由眾多炎性介質、細胞因子及蛋白酶等因素共同介導、相互作用的復雜的病理過程［4］。其中，缺氧、VEGF 和血管生成素及其之間的相互作用，就是促進新生血管的形成和穩定的主要因素［5］。RA患者的滑膜腔是一個慢性缺氧、低PH 值環境，HⅠF-1 是最重要的低氧信號傳遞因子，缺氧刺激HⅠF-1α的產生和穩定，繼而通過上調VEGF 的表達發揮促進血管新生作用［6］。Ang-1 和Ang-2 的表達亦受缺氧等的調控，并與VEGF 協同促進新生血管的成熟和重建［7］。CⅠA 大鼠模型是一種由膠原誘導的自身免疫性關節炎動物模型［8］，其癥狀、病理改變及致病機理與人類RA 有很多相似之處，被公認為研究RA 的經典動物模型，廣泛應用于觀察RA 病理機制及藥效學研究［9］。

RA 屬于中醫“痹證”范疇，外因由風、寒、濕三氣雜至，內因由正氣不足、肝腎虧虛為本，正所謂“邪之所湊，其氣必虛”。風寒濕邪侵襲經脈，痹阻氣血，故法應溫經通絡，補益肝腎。芍甘附子湯加味是在《傷寒論》芍藥甘草附子湯基礎上加味而成，是應用于臨床診治RA 多年的經驗有效方。方中白芍養血柔肝，能緩急止痛;附子溫經散寒，補火助陽，助以開經通絡;炙甘草補中益氣、緩急止痛，兼調和藥性。結合現代藥理學研究，白芍的有效成分白芍總苷具有解痙、鎮痛功效，制附子可抑制炎癥發展，有調節免疫的作用。在基礎方之上加以青風藤、川牛膝等共奏溫經通絡，補益肝腎之效。本課題組前期研究［2，10］也發現，芍甘附子湯加味可降低CⅠA 大鼠血清中ⅠL-1β、TNF-α 含量，抑制VEGF 及其受體KDR 的表達水平，降低滑膜病理學評分，有效改善關節炎癥，抑制血管新生，延緩RA 的病情進展。雷公藤多甙是從雷公藤的根部提取和精制而成的活性成分，被稱為“中草藥激素”［11］，具有抗炎和免疫抑制或免疫調節功能。有研究表明，雷公藤多甙可降低CⅠA 模型的發病率和嚴重性［12］，亦能降低血清炎癥因子如ⅠL-1β、TNF-α 和VEGF 等的表達［13］，表現出抗血管新生的作用;在臨床上已廣泛用于RA 的治療，并取得了肯定的療效，因此選取為本研究的陽性對照藥物。本研究通過建立CⅠA 大鼠模型，給予不同劑量芍甘附子湯加味治療，經干預后，CⅠA 大鼠關節腫脹度及AⅠ評分均有改善，滑膜組織中HⅠF-1α、Ang-1 和Ang-2 的表達也有不同程度地降低。

綜上所述，在RA 疾病過程中，血管新生起著關鍵作用，因此以血管新生為靶點將可能成為未來治療RA 的核心突破點。目前國外已有動物研究顯示，以VEGF 及其受體、HⅠF、血管生成素等為靶點的治療手段獲得一定的療效，但尚缺乏臨床證據和安全評價。本研究結果提示芍甘附子湯加味可能是通過改善滑膜腔內的氧缺乏和調節血管生成素的表達從而抑制滑膜血管新生，阻斷血管翳的形成，防止關節軟骨和骨組織的破壞，減輕炎癥癥狀，進而延緩RA 發病進程，為臨床早期干預RA 提供依據，但作用機制研究及臨床觀察仍需在今后進一步開展。

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