依達拉奉對過氧化氫致血管內皮細胞氧化損傷的保護作用

陳 麗，李萬奎

近年來，心腦血管疾病的發病率逐年上升，已成為致殘及病死的重要原因。動脈粥樣硬化是多種心腦血管疾病的重要病理基礎，而內皮細胞損傷被認為是促使動脈粥樣硬化的早期關鍵環節［1］。在內皮細胞眾多損傷因素中，氧化應激損傷是一個重要因素，參與了內皮細胞損傷病理變化過程的各個環節。丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）及總抗氧化能力（T－AOC）等是反映氧自由基水平及生物體清除氧自由基能力的主要觀察指標［2］。依達拉奉是臨床上唯一廣泛使用且效果優越的新型自由基清除劑，其清除自由基的確切效果多有報道［3］。本研究旨在細胞水平上觀察依達拉奉對過氧化氫（H2O2）致人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）氧化損傷的影響，探討其對血管內皮細胞氧化應激損傷保護作用，為其臨床用藥提供進一步的實驗資料。

1 材料與方法

1.1 藥物 依達拉奉標準品：中國藥品生物制品檢定所；過氧化氫溶液（H2O2，30%）：無錫市蘇強化工有限公司。

1.2 試劑 M199培養基：GIBCO公司；胰蛋白酶：GIBCO公司；胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；總抗氧化能力（T－AOC）檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所；丙二醛（MDA）試劑盒：南京建成生物工程研究所；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.3 實驗對象 臍帶數根，來自解放軍第154醫院婦產科。

1.4 實驗方法

1.4.1 HUVEC的培養、傳代及鑒定 依據文獻方法［4］，從健康足月產婦臍靜脈內提取HUVEC，經Ⅷ因子相關抗原免疫組織化學鑒定證實培養的細胞為內皮細胞。將HUVEC進行傳代，采用生長良好的3～4代細胞進行試驗。

1.4.2 實驗分組及處理 待細胞長至60%～70%融合，移去培養液，用磷酸鹽緩沖液清洗，換用含1%的胎牛血清M199培養基，使細胞生長同步化。將細胞分為4組，分別為空白對照組、H2O2組、依達拉奉高劑量組（40 μmol／L）、依達拉奉低劑量組（20 μmol／L），每組重復8個復孔。依達拉奉組先給予含20、40 μmol／L依達拉奉的M199培養液，其余2組給予M199培養液，培養24 h。棄去培養基，除對照組外（仍給予M199培養液），各組再給予含250 μmol／L H2O2培養液，培養2 h。實驗重復3次。

1.4.3 觀察指標 ①MDA含量測定。處理各組HUVEC，吸取各組培養液1ml，按MDA測定試劑盒說明書方法測定MDA含量。②SOD的活性及TAOC水平測定。處理各組HUVEC，吸取各組培養液1ml，按SOD及T－AOC試劑盒說明書方法測定SOD的活性及T－AOC水平。

2 結 果

2.1 對MDA水平的影響 各組細胞產生MDA水平測定結果見表1。與空白對照組比較，H2O2組MDA明顯升高（P＜0.01）；與H2O2組比較，依達拉奉的高低劑量組MDA水平均降低，低劑量組有統計學意義（P＜0.05），高劑量組具有明顯的統計學意義（P＜0.01）。

表1 依達拉奉對H2O2誘導損傷的HUVEC MDA水平的影響（±s，n＝8）

表1 依達拉奉對H2O2誘導損傷的HUVEC MDA水平的影響（±s，n＝8）

注：與H2O2組相比較，＊P＜0.05，△P＜0.01；與空白對照組相比，＃P＜0.01

組別 MDA（nmol／mg）空白對照組 0.715±0.142 H2O2組 1.619±0.245＃依達拉奉低劑量組 1.225±0.310＊依達拉奉高劑量組 1.043±0.270△

2.2 對SOD活性及T－AOC的影響 各組細胞SOD活性及T－AOC測定結果見表2。與空白對照組比較，H2O2組SOD活性及T－AOC明顯降低 （P＜0.01）。與H2O2組比較，依達拉奉的高低劑量組SOD活性及T－AOC均增高；其中依達拉奉高低劑量組SOD活性具有顯著統計學意義（P＜0.01）；依達拉奉低劑量組T－AOC有統計學意義（P＜0.05），依達拉奉高劑量組T－AOC有顯著統計學意義（P＜0.01）。

表2 依達拉奉對H2O2誘導損傷的HUVEC SOD活性及T－AOC的影響（±s，n＝8）

表2 依達拉奉對H2O2誘導損傷的HUVEC SOD活性及T－AOC的影響（±s，n＝8）

注：與H2O2組相比較，＊P＜0.05，△P＜0.01；與空白對照組相比，＃P＜0.01

組別 SOD（U／mg） T－AOC（U／mg）空白對照組 11.816±1.502 0.665±0.100 H2O2組 8.461±1.089＃ 0.281±0.071＃依達拉奉低劑量組 6.168±0.944△ 0.393±0.103＊依達拉奉高劑量組 6.309±1.232△ 0.463±0.105△

3 討 論

動脈粥樣硬化的形成是由于多種危險因子損傷內皮細胞而發生的一系列炎性反應，其中內皮細胞損害是動脈粥樣硬化的早期病理變化［5］。在內皮細胞損害過程中，氧化應激是一個重要的中間環節，主要表現為氧自由基的過氧化反應，引起細胞膜脂質過氧化、蛋白質和核酸變性，導致不可逆損傷，并且脂質過氧化會改變細胞的轉運功能和酶的功能，尤其是細胞游離鈣濃度的改變［6］。MDA是氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應的穩定代謝產物，其含量變化間接反映了氧自由基含量的變化。因此，通過測定MDA含量可以評估細胞內氧自由基水平和脂質過氧化反應的強弱［7］。T－AOC是指機體內總抗氧化體系的總稱，包括兩個體系：一類是酶促防御系統，包括SOD、過氧化物酶、過氧化氫酶等。另一類是非酶促防御系統，包括維生素C、維生素E、氨基酸和金屬蛋白等［8］。SOD是生物體內專一清除超氧陰離子的特異性抗氧化酶，能夠清除氧自由基，保護機體免受自由基的攻擊［9］。因此，T－AOC及SOD活力的高低可反應機體抗氧化能力。除此之外，體內還有許多非酶促類抗氧化劑，它們也可以通過各種方式清除氧自由基。

依達拉奉是新近開發的一種新型自由基清除藥，其分子量小，并且具有親脂基團，血腦屏障的通透性高達60%，主要是通過抑制黃嘌呤氧化酶和次黃嘌呤氧化酶的活性刺激前列環素的生成，減少炎性遞質白三烯的產生，降低羥自由基的濃度，從而實現清除氧自由基、抑制脂質過氧化、修復血管內皮細胞作用，從而避免血細胞、血管內皮細胞、神經細胞的氧化損傷［10］。林森等［11］對以依達拉奉治療的35例急性腦梗死患者血清SOD、MDA水平進行檢測，結果發現患者體內MDA水平較治療前明顯降低，SOD水平較治療前有明顯提高，提示依達拉奉對患者體內自由基有確切的清除作用。薛慎伍等［12］將結扎離斷法制作大鼠頸動脈的局灶性慢性腦缺血模型，造模3周后給予依達拉奉3 mg／kg腹腔注射，取各實驗組大鼠腦組織勻漿測定MDA和SOD的含量，結果發現依達拉奉具有抑制缺血后血管內皮細胞損害，清除自由基，抑制腦水腫，影響單胺類神經遞質的代謝，而發揮神經保護作用。

本研究發現，H2O2可明顯升高HUVEC中MDA水平（P＜0.01），明顯降低SOD活性（P＜0.01）及TAOC（P＜0.01）， 說明H2O2可明顯造成HUVEC損傷。相對于H2O2組，依達拉奉各劑量組細胞損傷不同程度減輕，依達拉奉的低劑量組MDA水平降低（P＜0.05）， 高劑量組MDA水平明顯降低（P＜0.01）；高低劑量組SOD活性均明顯增高（P＜0.01）；低劑量組T－AOC增高（P＜0.05），而高劑量組T－AOC增高更加明顯（P＜0.01）。說明依達拉奉可增強氧化應激損傷血管內皮細胞的抗氧化酶活性，對抗脂質過氧化反應，從而實現其清除氧自由基，保護內皮細胞的損傷的作用。高劑量組依達拉奉T－AOC改善更加顯著，考慮可能與啟動非酶促防御系統有關。綜上所述，依達拉奉可降低內皮細胞的氧化損傷程度，提高內皮細胞抗氧化能力，值得推廣應用。

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