G－CSF對東莨菪堿癡呆模型大鼠認知及ChAT表達的影響

丁 明，張 迅，王 威，遲 蕾

術后認知功能障礙 （postoperation cognitive dysfunction，POCD）是指麻醉手術后出現的一種焦慮、精神錯亂、人格改變及記憶受損的中樞神經系統(tǒng)并發(fā)癥，并且老年患者發(fā)生率較高。研究推測，腦中特定區(qū)域的膽堿能神經通路參與了老年人POCD的 發(fā) 生［1］。 粒 細 胞 集 落 刺 激 因 子 （granulocyte colony stimulating factor，G－CSF） 能夠誘導干細胞增殖、分化，促進神經營養(yǎng)因子釋放，從而加強神經芽殖、突觸發(fā)生、神經傳遞以及神經遞質釋放［2］，研究表明，G－CSF在腦缺血動物模型中具有神經保護作用［3］。常作為麻醉前用藥的東莨菪堿，因其具有抗膽堿作用，常被用來建立研究抗癡呆藥物的動物模型。本實驗應用東莨菪堿致大鼠認知障礙動物模型，進一步研究G－CSF對抗膽堿藥引起的認知障礙的影響及其相關機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 氫溴酸東莨菪堿（上海禾豐制藥有限公司，批號130401）；重組人粒細胞集落刺激因子 （山東齊魯制藥， 批號201305019TC）；PV－9001兔二步法檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；生物素化抗鼠IgG（武漢，博士德公司）；鼠抗ChAT多克隆抗體（武漢，博士德公司）；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.2 實驗動物選擇及分組 10月齡的Wistar雄性大鼠24只 （山東濟寧魯抗實驗動物中心提供），體質量（480±30）g，分籠飼養(yǎng)一周適應環(huán)境，自由攝食攝水。實驗前對大鼠使用Morris水迷宮（安徽淮北正華生物儀器設備有限公司）進行水迷宮適應性訓練兩次。隨機分三組：空白組（N組），東莨菪堿組（S組）和G－CSF干預組（G組），每組8只。N組腹腔注射生理鹽水1 ml，S組腹腔注射氫溴酸東莨菪堿1 mg／kg，G組腹腔注射氫溴酸東莨菪堿1 mg／kg后皮下注射G－CSF 50 μg／kg，連續(xù)5 d。

1.3 檢測指標

1.3.1 行為學測試 于每天給藥3 h后進行Morris水迷宮測試，測定大鼠從入水到爬上潛在平臺的時間（潛伏期）和總游泳路程。測試兩次取其平均值，兩次測試間隔1 h。

1.3.2 形態(tài)學檢查 ①實驗動物的灌注與取材大鼠末次水迷宮測試后，腹腔注射10%的水合氯醛3 ml／kg麻醉后暴露心臟，左心室內注射1%肝素2 ml后經左心室進行主動脈插管，絲線固定后右心耳處剪口，以400 ml生理鹽水快速沖洗血管，待肝臟顏色變?yōu)樯n白色并且無血液流出時，用4℃4%多聚甲醛灌注2 h，肢體尾部變硬后斷頭取腦，置入4%多聚甲醛中再固定24 h。將腦標本乙醇系列脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，石蠟切片機切片，制成4 μm厚連續(xù)切片。②海馬區(qū)膽堿乙酰轉移酶（ChAT）表達的測定 用免疫組化SP法測定ChAT的表達。鏡下觀察細胞核及細胞質染色，用計算機圖像系統(tǒng)分析攝片，測出陽性細胞個數。

2 結 果

2.1 各組潛伏期天數比較 N、S、G三組不同天數間經單因素方差分析，結果顯示潛伏期每一組不同天數間的差異均有統(tǒng)計學意義。進一步兩兩比較顯示，每一組中第3天與第1天間的差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；每一組中第5天與第1天見的差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），潛伏期均較第1天縮短。見表1。

表1 各組大鼠不同天數潛伏期（s）的比較（±s，n＝8）

表1 各組大鼠不同天數潛伏期（s）的比較（±s，n＝8）

注：與第1天比較，ΔP＜0.05

組別 第1天 第3天 第5天 F P N組 84.50±7.43 41.50±6.95Δ 17.25±4.80Δ 220.067 0.000Δ S組 81.75±7.98 65.50±6.99Δ 40.75±6.61Δ 65.520 0.000Δ G組 85.13±7.26 45.38±5.04Δ 28.25±5.75Δ 183.780 0.000Δ F 0.451 32.509 33.251 － －P 0.643 0.000Δ 0.000Δ － －

2.2 各組游泳距離各天之間比較 N、S、G三組不同天數間經單因素方差分析，結果顯示游泳距離的每一組不同天數間的差異均有統(tǒng)計學意義。進一步兩兩比較顯示，每一組中第3天與第1天間的差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；每一組中第5天與第1天見的差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），游泳距離均較第1天縮短。見表2。

表2 各組大鼠不同天數游泳距離（cm）的比較（±s，n＝8）

表2 各組大鼠不同天數游泳距離（cm）的比較（±s，n＝8）

注：與第1天比較，ΔP＜0.05

組別 第1天 第3天 第5天 F P N組 1501.13±168.71 858.00±171.19Δ 356.63±91.28Δ 119.508 0.000Δ S組 1492.88±193.00 1126.00±170.94Δ 769.50±118.89Δ 38.785 0.000Δ G組 1665.50±273.93 915.25±164.90Δ 582.00±157.55Δ 58.179 0.000Δ F 1.613 5.577 21.689 － －P 0.223 0.011Δ 0.000Δ － －

2.3 各組ChAT陽性細胞個數的比較 ChAT陽性細胞個數在不同組間經單因素方差分析后，結果顯示不同組間的差異均有統(tǒng)計學意義 （F＝43.049，P＝0.000＜0.05）， 進一步兩兩比較可得，N組與S組，G組與S組間ChAT陽性細胞個數的差異均有統(tǒng)計學意義，且細胞個數均低于S組。見表3。經過統(tǒng)計學檢驗，本實驗所有組間均符合方差齊性。

表3 各組ChAT陽性細胞個數比較（±s）

表3 各組ChAT陽性細胞個數比較（±s）

注：與S組比較，ΔP＜0.05

S組 8 32.63±4.37 G組 8 22.75±4.03Δ組別 樣本例數 個數 F P N組 8 14.75±3.06Δ 43.049 0.000Δ

3 討 論

本實驗選用成年雄性大鼠，首先因為老年大鼠膽堿能功能減退；其次，研究發(fā)現雌激素可以增強膽堿能神經元的功能、促進神經細胞生長并改善認知功能等［4］。

東莨菪堿是常見的抗膽堿藥，可以抑制中樞膽堿能通路功能。作為麻醉前用藥，其抑制腺體分泌作用強于阿托品等抗膽堿藥。東莨菪堿致大鼠認知功能獲得性障礙模型是一種較為成熟的研究抗癡呆藥物的動物模型。本實驗結果S組和N組相比，說明了該動物模型造模理想，模擬了麻醉和手術后膽堿能系統(tǒng)功能改變。

Morris水迷宮實驗是測試大鼠空間學習記憶能力的常用檢測方法，潛伏期和游泳距離可以反映大鼠認知功能的變化。本實驗結果表明，G－CSF可以改善東莨菪堿引起的空間學習記憶障礙，表現為G組第5天潛伏期和游泳距離較S組短。

G－CSF是一種骨髓干細胞動員劑，可以促進干細胞增殖并通過外周血向受損部位遷移［5］，可以促進神經營養(yǎng)因子的合成和分泌［6］以及修復部分受損的神經功能。本實驗結果G組ChAT陽性細胞個數高于S組，說明G－CSF在一定程度上修復了東莨菪堿造成的中樞膽堿能通路功能的損傷。

綜上所述，東莨菪堿致認知障礙的大鼠應用G－CSF干預治療，可以通過上調ChAT的表達，修復受損的膽堿能通路功能，促進大鼠學習和記憶等功能障礙的恢復。其改善認知功能的其他機制還需進一步研究。

［1］Ontl T，Xing Y，Bai L，et al.Development and aging of N－methyl－D－aspartate receptor expression in the prefrontal／frontal cortex of mice［J］.Neuroscience，2004，123（2）：467－479.

［2］Shyu WC，Lin SZ，Yang HI，et al.Functional recovery of stroke rats induced by granulocyte colony－stimulating factor－stimulated stem cells［J］.Circulation，2004，110（13）：1847－1854.

［3］Six I，Gasan G，Mura E，et al.Beneficial effect of pharmacological mobilization of bone marrow in experimental cerebral ischemia［J］.European Journal of Pharmacology，2003，458（3）：327－328.

［4］Dubal DB，Kashon ML，Pettigrew LC，et al.Estradiol protects against ischemic injury［J］.Journal of Cerebral Blood Flow＆Metabolism，1998，18（11）：1253－1258.

［5］Yung MC，Hsu CC，Kang CY，et al.A potential for granulocytecolony stimulating factor for use as a prophylactic agent for heatstroke in rats［J］.European Journal of Pharmacology，2011，661（1）：109－117.

［6］Ogawa A，Maeguchi M，Uchida Y，et al.Effect of tazarotene，an acetylenic retinoid，on human dermal fibroblast［J］.Japanese Journal of Pharmacology，1998，76（3）：317－319.