新型膽酸不對稱雙縮二氨基硫脲類衍生物的合成及其抗菌活性*

張麗娜，趙志剛，譚 炯，李 暉

(西南民族大學化學與環境保護工程學院，四川成都610041)

近年來，席夫堿由于其廣泛的生物化學性質，已成為越來越多研究人員關注的熱點［2］。然而雙席夫堿結構類化合物卻鮮有報道［3］。含有硫脲基的席夫堿顯示出良好的生物活性［4］，如抗腫瘤［5－6］、抗癌［7－8］、抗病毒［9－10］、抗細菌［11－13］、抗真菌［14－15］、抗瘧疾［16－17］及抗細胞增殖［18－19］等，具有潛在的藥用價值。

甾體是一類廣泛存在于生物體中并具有重要功能的化合物［20］，由于其獨特的化學結構，在母體上引入不同官能團能使其生物活性發生變化［21－22］。另外，在微波輻射條件下進行的有機反應，具有速率快、效率高和產物易純化等特點［23－25］。

Scheme 1

本文根據活性疊加原理，在微波輻射條件下，甾酮(1)與取代單縮二氨基硫脲(2a～2l)經縮合反應合成了12個新型的膽酸不對稱雙縮二氨基硫脲衍生物(3a～3l，Scheme 1)，其結構經1H NMR，IR，ESI-MS和元素分析表征。并測試了3a～3l對枯草芽孢桿菌(ATCC 6633)，金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)，大腸桿菌(ATCC 35218)和綠膿桿菌(ATCC 27853)的抑菌活性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

WRS-1B型數字顯微熔點儀(溫度未校正);Wzz-2B型自動旋光儀(CH2Cl2為溶劑);Agilent-400 MHz型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內標);PERKIN-ELMER1700型紅外光譜儀(KBr壓片);FINNIGAN-LCQ型質譜儀;VarioMICRO型自動元素分析儀;銳品-ECA-9272型電熱恒溫培養箱;東聯-DL-CJ-1N型垂直層流潔凈工作臺。

1 和 2 按文獻［26－28］方法合成;ATCC 6633，ATCC 6538，ATCC 35218和 ATCC 27853，中國普通微生物菌種保藏管理中心;其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1)3a～3l的常規合成通法

在圓底燒瓶中加入乙醇15 mL，1 0.42 g(1 mmol)，2 1 mmol及濃鹽酸2滴，攪拌下回流(80℃)反應9 h～12 h(TLC監測)。冷卻(析出固體)，過濾，濾餅用乙醇重結晶得白色固體3a～3l。

(2)3a～3l的微波合成通法

在圓底燒瓶中加入中性氧化鋁0.2 g，1 0.42 g(1 mmol)，2 1 mmol和濃鹽酸2滴，攪拌下微波輻射(500 W)反應4.0 min ～7.0 min(TLC 監測)。反應液用DMSO(3×10 mL)萃取，合并萃取液，加水20 mL(析出固體)，過濾，濾餅用乙醇重結晶得白色固體3a～3l。

3a:產率88%，m.p.142℃ ～143℃，［α］20D－87.73 °(c 0.57);1H NMR δ:11.72(s，1H，NH)，10.57(s，1H，NH)，8.10(s，1H，CH)，7.72～7.60(m，2H，ArH)，7.47～7.39(m，3H，ArH)，3.58(s，3H，OCH3)，1.31(s，3H，19-H)，1.01(s，3H，18-H)，0.77(d，J=6.4 Hz，3H，21-H);IR ν:3 327，3 230，2 950，2 876，1 738，1 704，1 635，1 519，1 450，1 386，1 267，1 181，1 015，761 cm－1;ESI-MS m/z:615{［M+Na］+};Anal.calcd for C33H44N4O4S:C 66.86，H 7.48，N 9.45;found C 66.97，H 7.46，N 9.47。

3d:產率91%，m.p.205℃ ～206℃，［α］20D－98.47 °(c 0.58);1H NMR δ:11.78(s，1H，NH)，10.66(s，1H，NH)，8.51(s，1H，CH)，8.09(s，1H，ArH)，7.52 ～7.50(m，1H，ArH)，7.44 ～ 7.42(m，2H，ArH)，3.59(s，3H，OCH3)，1.31(s，3H，19-H)，1.01(s，3H，18-H)，0.76(d，J=6.4 Hz，3H，21-H);IR ν:3 327，3 185，2 949，2 881，1 740，1 702，1 520，1 435，1 387，1 275，1 172，803 cm－1;ESI-MS m/z:649{［M+Na］+};Anal.calcd for C33H43N4O4SCl:C 63.19，H 6.91，N 8.93;found C 63.28，H 6.90，N 8.95。

3e:產率85%，m.p.168℃ ～169℃，［α］20D－126.96 °(c 0.60);1H NMR δ:11.74(s，1H，NH)，10.62(s，1H，NH)，8.08(s，1H，CH)，7.75 ～7.62(m，2H，ArH)，7.51(d，J=8.4 Hz，2H，ArH)，3.58(s，3H，OCH3)，1.31(s，3H，19-H)，1.01(s，3H，18-H)，0.76(d，J=6.4 Hz，3H，21-H);IR ν:3 320，3 188，2 942，2 876，1 737，1 695，1 591，1 443，1 315，1 228，1 096，830 cm－1;ESI-MS m/z:649{［M+Na］+};Anal.calcd for C33H43N4O4SCl:C 63.19，H 6.91，N 8.93;found C 63.07，H 6.92，N 8.91。

3g:產率87%，m.p.216℃ ～217℃，［α］20D－81.08 °(c 0.59);1H NMR δ:11.67(s，1H，NH)，10.55(s，1H，NH)，9.62(d，J=6.4 Hz，1H，OH)，8.01(s，1H，CH)，7.25(t，J=8.0 Hz，7.6 Hz，1H，ArH)，7.14(s，2H，ArH)，6.82(d，J=7.6 Hz，1H，ArH)，3.58(s，3H，OCH3)，1.27(s，3H，19-H)，1.01(s，3H，18-H)，0.76(d，J=6.0 Hz，3H，21-H);IR ν:3 318，3 200，2 949，2 873，1 740，1 704，1 613，1 513，1 436，1 329，1 222，1104，690 cm－1;ESI-MS m/z:631{［M+Na］+};Anal.calcd for C33H44N4O5S:C 65.10，H 7.28，N 9.20;found C 65.19，H 7.30，N 9.22。

3i:產率86%，m.p.234℃ ～235℃，［α］20D－107.52 °(c 0.60);1H NMR δ:11.76(s，1H，NH)，11.55(s，1H，OH)，10.78(s，1H，NH)，9.91(s，1H，OH)，8.56(s，1H，CH)，7.13(d，J=6.0 Hz，1H，ArH)，6.34(d，J=8.4 Hz，1H，ArH)，6.29(s，1H，ArH)，3.58(s，3H，OCH3)，1.27(s，3H，19-H)，1.00(s，3H，18-H)，0.76(d，J=6.4 Hz，3H，21-H);IR ν:3 316，3 225，2 951，1 732，1 713，1 628，1 582，1 511，1 462，1 332，1 211，1 109，811 cm－1;ESI-MS m/z:647{［M+Na］+};Anal.calcd for C33H44N4O6S:C 63.44，H 7.10，N 8.97;found C 63.52，H 7.08，N 8.95。

1.3 抗菌活性測試

以阿莫西林為陽性對照，DMSO為陰性對照，測定3a～3l對兩種革蘭氏陽性細菌(ATCC 6633和ATCC 6538)和兩種革蘭氏陰性細菌(ATCC 35218和ATCC 27853)的抗菌活性。采用二倍稀釋法與紙片擴散法進行抗菌活性篩選，每個測試重復三次，分別計算IC50及MIC值。

(1)IC50

對3，阿莫西林和環丙沙星分別用無菌DMSO溶解定容得濃度為640 μg·mL－1的母液。將母液依次稀釋為(640，320，160，80，40，20，10，5)μg·mL－1;0 μg·mL－1作為空白對照。將活化后的細菌接種在培養基中，菌液濃度配成0.5麥氏比濁標準，約含(1～2)×108CFU·mL－1，用 MH肉湯將菌液進行1∶100稀釋后，用無菌棉沾取菌液在營養瓊脂培養基平板表面均勻涂抹3次，室溫干燥10 min，將含有400 μL各梯度濃度藥液的無菌干燥濾紙片(直徑6 mm)貼放于培養基平板表面。于37℃恒溫孵化18 h測得抑菌圈直徑，計算IC50值。

(2)MIC

將活化后的細菌接種在培養基中，菌液濃度為0.5麥氏比濁標準，用MH肉湯將菌液進行1∶100稀釋后備用。將3和阿莫西林分別用無菌DMSO溶解定容得母液濃度為1 280 μg·mL－1。采用二倍稀釋法依次稀釋至濃度為(256，128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25)μg·mL－1;0 μg·mL－1作為空白對照。將1 mL菌液加入各梯度濃度藥物原液，于37℃恒溫孵化18 h，觀察結果并記錄MIC值。

2 結果與討論

2.1 微波輻射合成與常規合成對比

3a～3l的微波輻射合成法與常規合成法的對比結果見表1。

表1 微波輻射法與常規加熱法合成3a～3l的比較*Table 1 Comparison between microwave irradiation and conventional heating for synthesizing 3a～3l

由表1可見，微波輻射合成法具有以下優點:(1)反應速率增大了94～150倍，大大縮短了反應時間;(2)反應收率大大提高，從常規法的38%～62%提高至82%～91%。可見，微波合成法是一種高效、快捷的合成膽酸不對稱雙縮二氨基硫脲類衍生物的好方法。

2.2 表征

在1H NMR 譜圖中，δ 11.78～11.55 處的寬單峰和 δ 11.64 ～10.42處的單峰均為NH質子吸收峰;δ 8.69 ～8.00 處的單峰為CH=N上的活潑質子峰;δ 8.09～6.29處的吸收峰為苯環與噻吩環上的質子峰;δ 3.59 ～3.58處單峰為 CO2CH3質子峰;δ 1.31 ～1.27和 δ 1.01 ～1.00 處單峰與 δ 0.77 ～0.76處雙峰分別為甾體上19-位，18-位與21-位氫的特征峰。

在IR 譜圖中，3 413 cm－1～3 147 cm－1處的強吸收峰為N－H伸縮震動的特征峰;1 650 cm－1～1 506 cm－1與1 297 cm－1～1 236 cm－1處的強吸收峰分別為C=N與C=S的特征峰;1 742 cm－1～1 732 cm－1處的強吸收峰為CO2CH3中C=O吸收峰;1 713 cm－1～1 695 cm－1處的吸引峰則為甾酮中C=O基團的特征峰。

2.3 抗菌活性

3a～3l的抗菌活性結果見表2。由表2可見，3b，3f和3g對ATCC 6633顯示出良好的抑制效果，3g效果最佳;3b，3e，3f和 3j對 ATCC 6538顯示出抑制效果，3b與3e的活性優于3f與3j;3b，3e，3f和3k對ATCC 35218顯示出抑制效果，3f的活性明顯優于其他化合物，與標準對照藥物阿莫西林相當;3b，3e，3f和3k均對ATCC 27853顯示出抑制效果。由表2還可見，氨基硫脲上的取代基團為噻吩時只對革蘭氏陰性細菌有抑制作用。

3 結論

本文以甾酮為起始原料，在無溶劑條件下，微波促進合成了12個新型的膽酸不對稱雙縮二氨基硫脲衍生物，產率高達91%。該合成方法具有反應時間短、產率高、綠色環保等優點。

表2 3a～3l的抗菌活性*Table 2 Antibacterial activities of 3a～3l

抗菌活性測試結果表明:部分目標化合物具有良好的抗菌活性，其中，1-(2-羥基苯芐叉基)-5-［3-(3，7-二氧代-24-膽烷酸甲酯)亞甲基］二氨基硫脲(3f)的抗菌效果尤為顯著。該研究工作對該類新藥研發提供了一定的研究依據。

［1］胡云霞，李琬聰，周婷婷，等.1，2，3-三氮唑橋連水楊醛類席夫堿菊糖衍生物的合成及抑茵活性研究［J］.化學與生物工程，2014，31:27－30.

［2］Abdel M A A，Mohamed E Z，Suliman A A.Synthesis，spectral characterization，molecular modeling and antimicrobial studies of tridentate azo-dye Schiff base metal complexes［J］.J Mole Struct，2015，1084:36 －45.

［3］ 仇曉陽.二核雙席夫堿銅(Ⅱ)配合物的合成、晶體結構及抗菌活性研究［J］.無機化學學報，2014，30:1667－1672.

［4］胡慶紅，袁澤利，吳慶，等.二氨基硫脲雙核席夫堿和其配合物的合成與抗菌活性［J］.應用化學，2009，26:534 －537.

［5］Gustavo E C，Michael R H，Wara M A，et al.Initial evaluation of the antitumour activity of KGP94，a func-tionalized benzophenone thiosemicarbazone inhibitor of cathepsin L［J］.Eur J Med Chem，2012，58:568 －572.

［6］Ana I M，Ines L，Pilar S.Palladium(Ⅱ)and platinum(Ⅱ)bis(thiosemicarbazone)complexes of the 2，6-diacetylpyridine series with high cytotoxic activity in cisplatin resistant A2780cisR tumor cells and reduced toxicity［J］.J Inorg Biochem，2013，125:26 － 31.

［7］Floyd A B，Jeffrey T，Michael S J，et al.Synthesis and characterization of mixed-ligand diimine-piperonal thiosemicarbazone complexes of ruthenium(Ⅱ):Biophysical investigations and biological evaluation as anticancer and antibacterial agents［J］.J Mole Struct，2011，992:39 －47.

［8］Duraippandi P，Ashoka G S.Dinuclear zinc bis(thiosemicarbazone)complexes:Synthesis，in vitro anticancer activity，cellular uptake and DNA interaction studys［J］.Inorg Chim Acta，2013，408:152 － 161.

［9］Field H J，Reading M J.The inhibition of bovine herpesvirus-1 by methyl 2-pyridyl ketone thiosemicarbazone and its effects on bovine cell［J］.Antiviral Res，1987，7:245 －256.

［10］Andreas J K.Broad-spectrum antiviral activity including human immunodeficiency and hepatitis C viruses mediated by a novel retinoid thiosemicarbazone derivatives［J］.Eur J Med Chem，2011，46:1656 － 1664.

［11］Zhong Z M，Aotegen B，Xu H，et al.Structure and antimicrobial activities of benzoyl phenyl-thiosemicarbazone-chitosans［J］.Inter J Biol Macromole，2012，50:1169－1174.

［12］Diana I，Elena P，Sergiu S，et al.Synthesis，characterization，crystal structure and antimicrobial activity of copper(Ⅱ)complexes with a thiosemicarbazone derived from 3-formyl-6-methylchromone［J］.Polyhedron，2014，81:123 －131.

［13］仇麗穎，趙志剛，李琳，等.新型噻吩-2-甲醛不對稱雙縮二氨基硫脲衍生物的合成及其抗菌活性［J］.合成化學，2014，22:293 －297.

［14］Kusai A，Anne L，Magali A，et al.Synthesis，structure and antifungal activity of thiophene-2，3-dicarboxaldehyde bis(thiosemicarbazone)and nickel(Ⅱ)，copper(Ⅱ)and cadmium(Ⅱ)complexes:Unsymmetrical coordination mode of nickel complex［J］.J Inorg Biochem，2013，126:76 －83.

［15］Qin Y K，Xing R G，Liu S，et al.Novel thiosemicarbazone chitosan derivatives:Preparation，characterization，and antifungal activity［J］.Carbohydrate Polymers，2012，87:2664 －2670.

［16］Renata B O，Elaine M S F，Rodrigo P P S，et al.Synthesis and antimalarial activity of semicarbazone and thiosemicarbazone derivatives［J］.Eur J Med Chem，2008，43:1983 －1988.

［17］Kewal K，Sarah S，Antonio G S，et al.Highly potent anti-proliferative effects of a gallium(Ⅲ)complex with 7-chloroquinoline thiosemicarbazone as a ligand:Synthesis，cytotoxic and antimalarial evaluation［J］.Eur J Med Chem，2014，86:81 －86.

［18］Dimitra K D，Anastasia Gi，Nikolaos K，et al.Synthesis，characterization，crystal structure and antiproliferative activity of platinum(Ⅱ)complexes with 2-acetylpyridine-4-cyclohexyl-thiosemicarbazone［J］.Polyhedron，2007，26:2871 －2879.

［19］Ana I M，Carolina H，Ana R，et al.3，5-Diacetyl-1，2，4-triazol bis(4N-substituted thiosemicarbazone)palladium(Ⅱ)complexes:Synthesis，structure，antiproliferative activity and low toxicity on normal kidney cells［J］.J Inorg Biochem，2011，105:1613 －1622.

［20］金培元，巨勇.新型甾體綴合物的設計合成及活性研究［J］.化學進展，2007，19:1883 －1895.

［21］張曉佳，崔建國，李瑩，等.具有生理活性甾體肟類化合物的研究進展［J］.有機化學，2010，30:655 －661.

［22］廖莉，焦艷曉，姚秋翠，等.甾體含氮化合物的合成及抗腫瘤活性研究［J］.化學試劑，2012，34:211 －215.

［23］Lucas C L，Maria T M B，Karen M G，et al.Microwave versus conventional heating treatment［J］.Enzyme Micro Tech，2015，69:10 －18.

［24］Shidokht Ni，Khashayar G.Solvent and microwave effects on oxidation of aromatic α-diketones［J］.J Indus Engine Chem，2015，21:198 －205.

［25］趙志剛，石治川，劉強，等.新型豬去氧膽酸分子鉗人工受體的微波無溶劑合成及其對氨基酸甲酯的識別性能［J］.合成化學，2014，22(5):601 －607.

［26］李清寒，趙志剛.不對稱雙縮二氨基硫脲化合物的合成及表征［J］.西南民族大學學報(自然科學版)，2008，34:982 －984.

［27］Shi Z C，Zhao Z G，Liu M，et al.Solvent-free synthesis of novel unsymmetric chenodeoxycholic acid bis thiocarbazone derivatives promoted by microwave irradiation and evaluation of their antibacterial activity［J］.C R Chimie，2013，16:977 －984.

［28］崔建國，黃立梁，黃燕敏，等.一種具有抗腫瘤活性膽酸衍生物的合成新方法［J］.有機化學，2009，29:971－974.