Evofosfamide的合成工藝改進*

姚 坤，陳冬寅，李 飛

(南京醫科大學藥學院，江蘇 南京 211166)

氮芥類生物烷化劑是臨床廣泛使用的抗腫瘤藥物。環膦酰胺和異環膦酰胺等氮芥膦酰胺類前藥雖然能夠降低氮芥的毒副作用，但是其安全性仍然不能令人滿意［1］。重度乏氧是很多惡性腫瘤的特點，增加腫瘤細胞對放化療的耐受性、促使腫瘤血管生成和腫瘤細胞轉移，是重要的不良預后因子［2－3］。

Evofosfamide［(1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基-N，N-二(2-溴乙基)磷酰(1)］是2012年由默克公司研發的用于治療晚期胰腺癌的藥物，它是氮芥膦酰胺類潛藥。在正常組織中，由于氧的濃度較高，該藥物的硝基不被還原，從而以毒性較小的潛藥狀態存在。在腫瘤組織中，由于氧濃度較低，吸電子的硝基被還原為供電子的氨基，使藥物不能穩定存在而被代謝，釋放出強細胞毒性的氮芥類代謝產物，殺死腫瘤細胞。研究發現，1在缺氧條件下的細胞毒性遠高于在有氧的條件下的細胞毒性，最高相差1 000倍左右［4－5］。1在乏氧組織中具有高選擇性活性，它對遠離血管的乏氧組織有非常好的殺傷力，而傳統的抗癌藥物如吉西他濱可以比較好地清除靠近血管的癌組織，因此，兩者聯合用藥抗癌效果更佳［6］。將1與培美曲塞聯合用藥用于治療晚期非鱗狀非小細胞肺癌，療效更佳［7］。人體中的細胞周期檢查點激酶1抑制劑 AZD7762S能夠增強1的藥效［8］。目前，1已獲得美國FDA批準進行多項臨床試驗，其中治療胰腺癌和晚期軟組織肉瘤已經進入Ⅲ期臨床試驗，并獲得FDA批準進入快速通道［9］。

Scheme 1

2008年，Duan等［10］首次報道了1的合成路線。但文獻中只簡單介紹了關鍵中間體(3-甲基-2-硝基-3H-咪唑-4-基)甲醇(8)與氮芥類化合物(9)拼合制備1的方法。但8較為昂貴，迄今為止，其合成方法鮮有文獻［11］報道。該方法以N-甲酰肌氨酸甲酯(3)為原料，經縮合、環合、氧化、水解和還原反應等5步反應制得8;8再與9拼合得1，總收率8%，且其中兩步反應需柱層析分離，不適合工業化生產。因此，對1的合成工藝進行探索具有重要的意義。

為了建立1的有效合成方法，本文在文獻［11］方法的基礎上，以肌氨酸甲酯鹽酸鹽(2)為原料，與甲酸乙酯經過甲酰化和縮合兩步反應制得鈉(E)-3-甲氧基-2-(N-甲酰基)-3-氧代丙基-1-氨乙基-1-鹽(4);4在氰胺和乙酸鈉作用下環合得1-N-甲基-2-氨基咪唑-5-羧酸乙酯(5);5經氧化得1-N-甲基-2-硝基咪唑-5-羧酸乙酯(6);6在堿性條件下水解、再還原羧基制得關鍵中間體8;8與9經過Mitsunobu反應合成了1(Scheme 1)，總收率16%，其結構經1H NMR，13C NMR和HR-ESIMS確證。并對3，5和6的合成工藝進行改進。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker ARX-300型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內標);Agilent-1100型質譜儀。

薄層層析用GF254型硅膠，青島海洋化工廠生產;其余所用試劑均為分析純或化學純。

1.2 合成

(1)3的合成

在反應瓶中加入甲酸乙酯90 mL(1.11 mol)和乙醇80 mL，攪拌下依次加入2 20 g(0.14 mol)和碳酸鉀20 g，于35℃反應2 h。抽濾，濾液減壓濃縮，干燥得淡黃色固體 3 15 g，產率 82%;1H NMR δ:8.62(s，1H)，4.68(s，2H)，3.68(s，3H)，3.47(s，3H);HR-ESI-MS m/z:Calcd for C5H9NO3{［M+H］+}131.057 7，found 131.058 2。

(2)5的合成

在反應瓶中加入3 5 g(38.2 mmol)和甲酸乙酯16 mL(0.20 mol)，攪拌使其溶解;冷卻至0℃，分批加入 NaH 1.6 g(60%油狀混懸液，40 mmol)，加畢，于室溫反應過夜。有黏稠物析出，用刮刀取出，置研缽中，加入己烷20 mL，研磨;不溶物用混合溶劑［EtOH(10 mL)+濃鹽酸(6 mL)］溶解，于110℃攪拌反應1 h。冷卻至室溫，過濾，濾餅用乙醇洗滌。合并濾液和洗液，減壓濃縮得深棕色油狀物。加入混合溶液［NH2CN 3.5 g(83 mmol)+乙酸鈉9 g+10%HOAc 20 mL］中，于80℃反應1 h。反應混合物減壓濃縮至1/3，用20%碳酸鈉溶液調至pH≈9。用乙酸乙酯萃取，合并有機相，用無水Na2SO4干燥。減壓濃縮得棕灰色固體，用丙酮重結晶得灰白色固體粉末5 4.8 g，產率 75%;1H NMR δ:7.62(s，1H)，4.20 ～4.10(m，2H)，3.52(s，3H)，1.53 ～1.50(m，3H);HR-ESI-MS m/z:Calcd for C7H11N3O2{［M －H］－}169.084 6，found 169.085 1。

(3)6的合成

在反應瓶中加入亞硝酸鈉10 g(0.14 mol)和水30 mL，攪拌使其溶解;冰水浴冷卻，滴加5 3.7 g(21.9 mmol)的乙酸(20 mL)溶液，滴畢，于室溫反應過夜。用二氯甲烷萃取，合并有機相，用無水Na2SO4干燥。減壓濃縮得微紅色固體，用丙酮重結晶得淡棕色固體6 2.8 g，產率65%;1H NMR δ:8.03(s，1H)，4.23 ～4.10(m，2H)，3.73(s，3H)，1.30 ～ 1.27(m，3H);HR-ESI-MS m/z:Calcd for C7H9N3O4{［M+H］+}199.058 8，found 199.059 3。

(4)7的合成

在反應瓶中加入 6 3.9 g(19.6 mmol)，1 mol·L－1NaOH溶液60 mL和水20 mL，攪拌使其溶解;于室溫攪拌至溶液變為透明淺棕色。用濃鹽酸調至pH 1，用乙酸乙酯萃取，合并有機相，用無水Na2SO4干燥。減壓濃縮得淡棕色固體7 3.2 g，產率 95%;1H NMR δ:11.50(br s，1H)，8.17(s，1H)，3.72(s，3H);HR-ESI-MS m/z:Calcd for C5H5N3O4{［M －H］－}171.027 5，found 171.028 0。

(5)8的合成

在反應瓶中加入7 3.1 g(18.0mmol)和THF 36 mL，攪拌使其溶解;加入三乙胺14 mL，冰鹽浴冷卻，滴加氯甲酸異丁酯3.8 mL(28.8 mmol)，滴畢，反應1 h。于0℃加入硼氫化鈉3.6 g，緩慢滴加水60 mL，滴畢(約需1 h)，有固體析出。過濾，濾餅用THF洗滌，合并濾液和洗液，減壓濃縮，殘余物用乙酸乙酯重結晶得橙色固體8 2.5 g，產率88%;1H NMR δ:7.44(s，1H)，4.63(s，2H)，3.72(s，3H);HR-ESI-MS m/z:Calcd for C5H7N3O3{［M －H］－}157.048 2，found 157.048 7。

(6)1的合成

在反應瓶中加入8 3.6 g(22.9 mol)和 THF 100 mL，攪拌使其溶解;依次加入三苯膦3 g，9 1.8 g(5.7 mmol)和二異丙基偶氮二羧酸酯(DIAD)2 mL，于室溫反應2 h。減壓濃縮，殘余物經快速硅膠柱層析［梯度洗脫劑:V(甲苯)∶V(丙酮)=3 ∶0 ～3 ∶7］純化得米白色固體1 4.9 g，產率 48%;1H NMR δ:7.23(s，1H)，5.04 ～ 5.12(m，2H)，4.95(d，J=7.60 Hz，2H)，3.94(s，3H)，3.42(t，J=7.24 Hz，4H)，3.01 ～ 3.17(m，4H);13C NMR δ:146.04，134.15(d，J=32.00 Hz)，126.20，55.60，42.74，34.36，34.11(d，J=17.40 Hz);HR-ESI-MS m/z:Calcd for C9H16N5O4PBr2{［M － H］－}446.930 2，found 446.930 7。

2 結果與討論

1的合成，文獻［11］方法以3為起始原料，經6步反應合成。該方法存在反應操作繁瑣，總產率較低(6%)，合成過程中兩步反應需硅膠柱色譜進行分離純化等缺陷，不適合工業化生產。本文采用價格較為便宜的2為起始原料的方法，經7步反應合成1。

在3的合成中，通過考察反應溫度對收率的影響，得出35℃為最佳反應溫度，使收率由76%(25℃)［11］提高至82%，反應時間也縮短至2 h。

在5的合成中，將反應溫度由95℃［11］降至80℃ ～85℃，減少了由于高溫所帶來的副產物，進而提高了收率。

在6的合成中，首先采用了文獻［11］方法中的硅膠柱色譜分離法，但由于反應本身不完全，且6與5極性差別較小，硅膠柱色譜分離造成產物損失，降低收率。為此，本文分別選用了乙醇、乙酸乙酯、甲苯和丙酮等溶劑重結晶的方法代替硅膠柱色譜分離。實驗結果表明:經丙酮重結晶的6，純度得到提升，且降低了實驗的繁瑣程度。

經過對3，5和6的工藝改進，不僅總收率提高至16%，而且操作簡單，更適合于工業化生產。

［1］Kumar D，Tewari-Singh N，Agarwal C，et al.Nitrogen mustard exposure of murine skin induces DNA damage，oxidative stress and activation of MAPK/Akt-AP1pathway leading to induction of inflammatory and proteolytic mediators［J］.Toxicology Letters，2015，235(3):161－171.

［2］劉小艷，許新華.乏氧微環境與腫瘤治療抗拒［J］.廣東醫學，2013，34(23):3667 －3669.

［3］Gilkes D M，Semenza G L，Wirtz D.Hypoxia and the extracellular matrix:Drivers of tumour metastasis［J］.Nat Rev Cancer，2014，14(6):430 －439.

［4］Yeh J J，Kim W Y.Targeting tumor hypoxia with hypoxia-activated prodrugs［J］.Journal of Clinical Oncology，2015，33(13):1505 －1508.

［5］Liu Q，Sun J D，Wang J，et al.TH-302，a hypoxiaactivated prodrug with broad in vivo preclinical combination therapy efficacy:Optimization of dosing regimens and schedules［J］.Cancer Chemotherapy and Pharmacology，2012，69(6):1487 －1498.

［6］Borad M J，Reddy S G，Bahary N，et al.Ranomized phase II trial of gemcitabine plus TH-302 versus gemcitabine in patients with advanced pancreatic cancer［J］.Journal of Clinical Oncology，2015，33(13):1475 －1482.

［7］Goldman J，Belani C，Novello S，et al.Randomized，double-blind，placebo-controlled trial of evofosfamide(TH-302)in combination with pemetrexed in advanced non-squamous non-small cell lung cancer［J］.Annals of Oncology，2015，26(Suppl 1):29 －44.

［8］Sun J D，Meng F Y，Liu Q，et al.Association between Chk1 inhibitor AZD7762-mediated modulation of pharmacodynamic biomarkers and potentiation of hypoxia-activated prodrug evofosfamide(TH-302)antitumor efficacy in a human tumor xenograft model［M］.San Francisco，American Association for Cancer Research，2015.

［9］http://www.fiercebiotech.com/tags/threshold-pharmaceuticals.

［10］Duan J，Jiao H，Kaierman J，et al.Potent and highly selective hypoxia-activated achiral phosphoramidate mustards as anticancer drugs［J］.Journal of Medicinal Chemistry，2008，51(8):2412 －2420.

［11］Matteucci M，Duan J，Jiao H，et al.氨基磷酸酯烷化劑前體藥物［P］.CN 200 680 030 082.8，2009.