大柴胡湯對豚鼠膽囊黏蛋白分泌及其基因表達的影響*

★ 陳小菁 胡曉晴 許亞超 韋宇峰 鄭志祥 楊軍平 張元 (．江西中醫藥大學附屬醫院普外科 南昌0006;．江西中醫藥大學護理學院 南昌000;．江西中醫藥大學0級碩士研究生 南昌0006;．江西中醫藥大學附屬醫院檢驗科 南昌0006)

膽石病的發病原因至今仍未完全闡明。現已證實，膽汁成分的改變，致石膽汁的形成，是膽石病產生與發展的重要因素，目前發現的促成致石膽汁的核蛋白包括免疫球蛋白、黏蛋白等［1－2］。在膽石形成中，大量的黏蛋白分泌，增高了致石膽汁的黏滯度，有利于膽石的形成。可見，有效的降低膽汁中黏蛋白的含量，逆轉致石性病理膽汁是預防膽石生成及膽石復發的關鍵［3］。中醫藥是通過多靶點、多環節、多途徑來發揮防治膽石病的作用。本研究通過隨機對照動物實驗，探討大柴胡湯對豚鼠膽囊壁黏膜細胞分泌黏蛋白、膽固醇及膽汁酸的影響，以及是否調節黏蛋白基因的表達。

1 材料與方法

1．1 藥品 大柴胡湯(柴胡15g、黃芩9g、芍藥9g、半夏9g、生姜15g、枳實9g、大棗5枚、大黃6g)，常規水煎，分別濃縮成含生藥量0．6g/mL、1．2g/mL、2．4g/mL三種劑量，4℃冰箱保存備用。熊去氧膽酸片，上海中西三維藥業有限公司生產，批號:H37020552;膽固醇，1kg/袋，南昌賽爾(長城生物)有限公司生產，批號:20150118;魚肝油，500mL/瓶，廈門星鯊藥業集團生產，批號:閩飼預字(2010)035015;總膽固醇試劑盒，上海科華東菱診斷用品有限公司生產，批號:20150213;Rat TBA Elisa Kit，美國進口，批號:201503;生理鹽水，河南太龍藥業股份有限公司生產，批號:1105045。

1．2 動物 健康SPF級雄性豚鼠60只，體重180～220g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，合格證號:SCXK(湘)2011－0003。

1．3 儀器 DY89－1型電動玻璃勻漿機，寧波新芝生物科技股份有限公司生產;可調式移液器，上海雷勃分析儀器有限公司生產;TGL－16G高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠生產;BIO－RAD－680型酶標儀，美國BIO－RAD公司生產;BTS－100型全自動生化儀，淄博恒拓分析儀器有限公司生產;UV1000型紫外/可見分光光度計，上海天美科學儀器有限公司生產;羅氏P80全自動生化分析儀，上海政翔化學試劑研究所生產;Genelight2400 PCR儀器，廈門安普利生物工程有限公司生產。

1．4 實驗方法

1．4．1 造模 本實驗根據周文江等在中國實驗動物學雜志上發表的制造豚鼠膽囊結石模型的方法建立豚鼠膽固醇結石模型［4］:取豚鼠60只隨機分成6組(空白對照組、模型組、低劑量中藥組、中劑量中藥組、高劑量中藥組、熊去氧膽酸組)，取其中5組予成石飼料(普通飼料中添加1．2%膽固醇、5%蔗糖、3．5%魚肝油)飼喂80天，正常組予普通飼料喂養。

1．4．2 給藥 造模后，對照組及模型組予正常飼料加生理鹽水灌胃喂養8周，其他4組分別予中藥大柴胡湯按低劑量(6g/(kg·d))、中劑量(12g/(kg·d))、高劑量(24g/(kg·d))，熊去氧膽酸(10g/(kg·d))灌胃加正常飼料喂養8周。

1．4．3 標本采集與檢測 8周后分批處死豚鼠，動物處死前24h禁食禁水，予3%戊巴比妥鈉0.15mL/100g腹腔注射麻醉豚鼠，將豚鼠仰位固定于手術板，腹部剪毛后沿腹白線(腹正中線)剖開腹腔，尋找到膽囊，仔細抽吸膽汁，肉眼觀察有無結石，然后切除膽囊并剖開，再次觀察有無結石形成并作記錄。在無菌操作下仔細刮除黏膜后，將膽囊標本放置于凍存管，于液氮中低溫保存。膽汁中總膽汁酸(TBA)含量采用酶聯免疫分析(ELISA)測定;膽汁中黏蛋白濃度采用磷鎢酸沉淀－酚試劑法測定;膽固醇采用酶比色法測定，全自動生化儀檢測;膽囊壁組織用蘇木精－伊紅病理染色，光鏡下觀察;膽囊黏蛋白基因表達情況采用RT－PCR方法進行研究觀察。

1．5 統計學處理 數據分析用SPSS19．0統計軟件包進行數據資料的統計學處理，計量資料用ˉx±s表示，各組間比較采用單因素方差分析，方差檢驗齊者用最小顯著差數(LSD)法，方差不齊者用Games－Howell法檢驗。

2 結果

2．1 大柴胡湯對豚鼠膽汁中黏蛋白濃度的影響結果見表1。模型組豚鼠膽汁中黏蛋白濃度明顯高于空白組，中藥組黏蛋白濃度明顯低于熊去氧膽酸組，熊去氧膽酸組黏蛋白濃度較模型組明顯降低(P＜0．05)。

表1 大柴胡湯對豚鼠膽汁中黏蛋白的影響(ˉx±s，n=10)

2．2 大柴胡湯對豚鼠結石及膽汁分泌量的影響結果見表2。大柴胡湯能溶、排膽囊膽固醇結石，且低劑量效果較佳;低劑量大柴胡湯可明顯促進膽汁分泌，中、高劑量大柴胡湯對膽汁分泌的促進作用相對較弱。

表2 大柴胡湯對豚鼠結石、膽汁分泌量的影響(n=10)

2．3 大柴胡湯對豚鼠膽汁中膽固醇、膽汁酸含量的影響 結果見表3。與模型組相比，低劑量、中劑量大柴胡湯組和熊去氧膽酸片組豚鼠膽汁中膽汁酸含量較高(P＜0．01);在各組中，低劑量大柴胡湯組豚鼠膽汁中膽汁酸含量最高(P＜0．05)，中劑量及高劑量大柴胡湯組則相對較高;低劑量大柴胡湯組豚鼠膽汁中膽固醇含量最低(P＜0．01)。

表3 大柴胡湯對豚鼠膽汁中膽固醇、膽汁酸含量的影響(xˉ±s，n=10)

表4 大柴胡湯對豚鼠膽囊黏蛋白基因表達的影響(ˉx±s，n=10)

2．4 大柴胡湯對豚鼠膽囊壁組織的病理改變 光鏡下，正常組膽囊黏膜上皮細胞呈單層柱狀排列，黏膜皺壁完整。模型組膽囊部分被復腺上皮脫落或增生，黏膜間質水腫、充血、炎細胞浸潤，而觀察組、對照組的上述病變較輕。

2．5 大柴胡湯對豚鼠膽囊蛋白基因表達的影響結果見表4。與模型組相比，低劑量、中劑量、高劑量大柴胡湯組和熊去氧膽酸片組豚鼠膽囊黏蛋白基因MUC3表達明顯較低(P＜0．01)，高劑量大柴胡湯組和熊去氧膽酸片組豚鼠膽囊黏蛋白基因MUC1、MUC2表達明顯偏低(P＜0．01);低劑量、中劑量大柴胡湯組豚鼠膽囊黏蛋白基因MUC1、MUC2表達較低(P＜0．05)。

3 討論

中醫學認為，膽石病和膽囊炎均為由氣及血，肝膽氣郁與膽汁壅阻、痰瘀互結互為因果，使得結石不斷增大，炎癥反復不愈，不斷損傷肝膽功能，形成了惡性循環，最終濕熱越聚越重衍生百病［5］。中醫認為，“按之心下滿痛者，此為實也，當下之，宜大柴胡湯”。大柴胡湯中柴胡、枳實、黃芩具有清利郁熱、疏肝利膽的功效;甘草坐鎮中州，合白芍酸甘化陰，既可以緩和瀉下藥物傷陰，同時防止邪熱入里傷陰。從現代藥理學分析，大黃內的大黃素能有效地解除乙酰膽堿導致的痙攣，有松弛括約肌、加強膽囊收縮、膽管擴張，促進膽汁的排泄，驅除膽道異物且有抗菌作用;柴胡可以增加膽固醇－膽鹽系數，具有極強的利膽功能;白芍可以松弛肌肉，有助于膽汁排泄并具備鎮痛作用［6－7］。

當膽汁中膽汁酸含量低而膽固醇含量高時，易形成膽固醇結晶。模型組的總膽汁酸較正常組明顯低，而膽固醇、黏蛋白含量則較高。觀察組能升高總膽汁酸濃度，降低膽固醇、黏蛋白含量，且作用明顯優于對照組。黏蛋白可作為膽石基質網絡膽固醇結晶，或作為成核因子促使膽石形成，其濃度過高，還會增加膽汁黏度，使膽汁流動緩慢，易析出膽固醇結晶。結石膽囊黏膜中黏蛋白的表達與結石的形成密切相關［8－10］。有文獻報道，約50%的結石膽囊黏膜中存在不同黏蛋白基因的表達［8］。本研究通過觀察各組膽囊形態變化，發現模型組膽囊有明顯的炎癥、水腫，其炎癥刺激了膽囊黏蛋白分泌，故膽汁中黏蛋白濃度高。另外，水腫膽囊還使膽汁排泄不暢。應用大柴胡湯治療后，發現膽汁中黏蛋白含量、膽汁黏度明顯降低，膽囊水腫減輕，改善了膽囊動力學環境。

本研究共測定了3種粘蛋白，其中MUC1、MUC2、MUC3在膽囊組織均有表達，這和陳東風等［11］的報道一致。我們發現，MUC1在結石豚鼠膽囊黏膜中存在，而且比MUC2、MUC3表達的陽性率高，提示MUC1可能是正常膽囊黏膜上皮細胞分泌的主要黏蛋白。黏蛋白與結石形成及膽囊炎癥之間的關系較為復雜，推測可能系多種原因引起黏蛋白大量分泌，分子結構變化，導致或促進了膽囊結石的形成，而結石又刺激黏膜炎癥的發生，腺體增生，進一步導致黏蛋白分泌改變，使結石逐漸變大，但它們之間的確切關系尚需進一步研究。

本研究發現，低劑量、中劑量、高劑量大柴胡湯和熊去氧膽酸片可明顯降低豚鼠膽囊黏蛋白基因MUC3的表達(P＜0．01)，高劑量大柴胡湯和熊去氧膽酸片可明顯降低豚鼠膽囊黏蛋白基因MUC1、MUC2的表達(P＜0．01)，低劑量、中劑量大柴胡湯可降低豚鼠膽囊黏蛋白基因MUC1、MUC2的表達(P＜0．05)。這可能與大柴胡湯治療后，改善了膽囊動力學環境有關。

實驗提示，大柴胡湯可使豚鼠膽汁中膽汁酸含量顯著升高，使膽固醇含量顯著降低;降低黏蛋白濃度，降低豚鼠膽囊黏蛋白基因表達，以小劑量為佳，中劑量次之，證明了大柴胡湯能降低豚鼠膽囊黏蛋白分泌及基因表達。本實驗為臨床提供了應用依據。從本次的研究可看出，運用大柴胡湯能較好溶、排膽囊膽固醇結石，其機制與調節脂質代謝，改善致石性膽汁及糾正膽囊動力學并降低膽囊粘蛋白基因表達等作用有關。

［1］梁力建，殷曉煜．膽道外科實驗研究的現狀與展望［J］．中華實驗外科雜志，2007，24(12):1 454－1 456．

［2］張延齡．實用外科學［M］．第3版．北京:人民衛生出版社，2012:730－732．

［3］郭振武．實用膽囊外科［M］．天津:天津科學技術出版社，1996:14－15．

［4］周文江，楊幼明，方玉晢，等．豚鼠膽囊膽固醇結石模型的建立［J］．中國實驗動物學雜志，1998，9(4):198－200．

［5］董浩，齊海燕．大柴胡湯加減治療膽石癥、膽囊炎61例臨床觀察［J］．河北中醫，2014，36(7):1 020－1 021．

［6］武華成．大柴胡湯加減治療慢性膽囊炎30例［J］．中醫臨床研究，2011，3(11):77－79．

［7］王曉春．大柴胡湯加減治療膽石癥97例［J］．實用中醫內科雜志，2011，25(4):80．

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［11］陳東風，鄭偉，易萍．粘蛋白在結石性膽囊炎中的變化及意義［J］．第三軍醫大學學報，2002，12(2):197－199．