當歸多糖對結腸炎小鼠peyer's patches結T淋巴細胞亞群水平的調控作用*

★　潘琦虹　李燕珍　劉端勇　趙海梅　(.江西中醫藥大學科技學院　南昌 33005；.江西中醫藥大學基礎醫學院　南昌 330004)

*基金項目：江西省衛生廳中醫科研計劃項目(2008A068)。

?

當歸多糖對結腸炎小鼠peyer's patches結T淋巴細胞亞群水平的調控作用*

★潘琦虹1李燕珍1劉端勇1趙海梅2**(1.江西中醫藥大學科技學院南昌 330025；2.江西中醫藥大學基礎醫學院南昌 330004)

*基金項目：江西省衛生廳中醫科研計劃項目(2008A068)。

摘要：目的：探討當歸多糖對潰瘍性結腸炎小鼠小腸peyer's patches結(PP結)T淋巴細胞亞群水平的調控作用。方法：50只雄性小鼠分成5組，正常對照組(normal)、模型對照組(model)、當歸多糖低劑量觀察組(low)、當歸多糖高劑量觀察組(high)、柳氮磺吡啶陽性對照組(SASP)，采用傳統的TNBS乙醇復合法建立小鼠潰瘍性結腸炎模型，給藥7d后，觀察小鼠病理組織學變化，并分離其小腸上皮淋巴細胞，檢測各種淋巴細胞亞群水平。結果：各觀察組結腸指數、結腸損傷評分、病理組織學評分較模型組明顯下降(P<0.01或P<0.05)。同時當歸多糖在一定的劑量下，可明顯下調PP結中CD4+、CD8+T細胞水平(P<0.01或P<0.05)，且高劑量組可降低CD4/CD8水平(P<0.05)。結論：當歸多糖可緩解潰瘍性結腸炎結腸粘膜損傷，且緩解作用可能與調節結腸炎小鼠小腸PP結淋巴細胞亞群平衡、糾正腸粘膜免疫狀態的紊亂有關。

關鍵詞：當歸多糖；潰瘍性結腸炎；淋巴細胞亞群；粘膜免疫

潰瘍性結腸炎是一種以結腸(直腸)粘膜慢性炎癥和潰瘍形成為特點的疾病，其發病與粘膜免疫狀態密切相關。據報道，當歸多糖可調節免疫及治療實驗性潰瘍性結炎，但其能否調節粘膜免疫治療潰瘍性結腸炎的作用并沒有實驗證實。

1實驗材料

1.1動物昆明小鼠50只，清潔級，18～22g，雄性，購于湖南景達斯萊克實驗動物公司(SCXK 2009-0004)。

1.2藥物當歸多糖購于江西中醫學院附屬醫院中藥房，經中藥鑒定室鑒定，由教育部重點實驗室提取分離，純度為95%，干燥粉末，-4℃下保存備用。柳氮磺吡啶(SASP)(滬衛藥準字(1995)第002083號)由上海三維制藥有限公司生產。

1.3主要試劑及儀器2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid(TNBS)購于sigma公司(2508-19-2)，單克隆熒光標記抗體CD3-PE、CD4-APC、CD8-FITC均購于eBioscience公司。光學顯微鏡(OLYMPUS公司)、Leica圖像分析儀(LEICA DC100，德國LEICA公司)、流式細胞儀(FACSCalibur型，美國BD公司)

2實驗方法

2.1造模方法[1]模型對照組、當歸多糖觀察組、柳氮磺吡啶陽性對照組動物，復合麻醉劑麻醉后，用塑料軟管(直徑1mm)插入肛門4cm，按體重注入100mg/kg含30%乙醇的TNBS藥液，小鼠倒立1min使藥液達全結腸，然后動物放回原籠中自然蘇醒；正常對照組小鼠注入等量的生理鹽水。

2.2分組與給藥昆明小鼠50只，經適應性飼養3d后，按體重隨機分為5組，即正常對照組、模型對照組、當歸多糖高劑量觀察組、當歸多糖低劑量觀察組、柳氮磺吡啶陽性對照組，每組10只。造模成功后第1d，按體表面積換算，當歸多糖低、高劑量觀察組分別給予0.5g/kg、1g/kg灌胃給藥；而柳氮磺吡啶對照組給予60mg/kg；正常組和模型組均給予等容積的蒸餾水同等方法灌胃，連續給藥7d，每天一次。第8d脫椎處死動物，分離小腸、結腸等，待用。

2.3取材各組動物在末次給藥后禁食12 h，脫椎處死動物，迅速自肛門上2cm處向上分離結腸6～8cm，稱重，計算結腸重量指數(結腸指數=結腸重(g)/體重(kg)×100%)。剪取部分結腸組織，10%福爾馬林溶液固定，病理切片，HE染色，光鏡下觀察潰瘍生成情況，部分結腸組織迅速于液氮中保存待用。分離小腸，收集小腸PP結。

2.4結腸組織損傷評分及評分標準動物處死后，迅速分離結腸，沿腸系膜縱軸剪開，用生理鹽水沖洗干凈，并將腸粘膜向上平鋪于蠟板上固定，觀察炎癥及潰瘍發生情況，根據炎癥損傷程度進行結腸組織損傷評分，其評分標準[2]為：0分：無損傷；1分：粘膜充血、水腫、未出現潰瘍；2分：粘膜充血、水腫、輕度糜爛，無潰瘍；3分：粘膜充血、水腫、中度糜爛，有單個潰瘍；4分：粘膜充血、水腫、高度糜爛，有多處潰瘍；5分：粘膜充血、水腫、重度糜爛，有>1cm潰瘍。鏡下病理損傷評分參考Dielman等[3]提出的評分標準，評分指標包括潰瘍、炎癥、肉芽腫、及病變深度,按有無及輕重分別記0、1、2分，病變深度達黏膜下層、肌層、漿膜層分別計1、2、3分。各項相加得總分。

2.5機械分離法分離小腸PP結淋巴細胞禁食12h后，脫椎處死動物，取出全部小腸，置于冰生理鹽水中，剝離腸系膜和脂肪組織，用生理鹽水沖洗腸腔5～7遍，洗去小腸內容物，從小腸腸壁上剪下的PP結，置冰生理鹽水中反復清洗3～5遍，將PP結置于300目細胞篩中，加適量1640培養液研碎，制成PP結組織勻漿，濾液1500rpm，離心5min，去上清，兩次，加入1mL的1640培養液搖勻，即得。

2.6流式細胞術檢測PP結淋巴細胞亞群檢測分別取細胞懸液100μL與CD3(0.5μg)/CD4單克隆抗體(0.25μg)和CD3(0.5μg)/CD8單克隆抗體(0.125μg)的離心管中震勻，4℃下孵育30min；加入適量生理鹽水，以1500 r/min離心1.5min，反復幾次，棄其上清，加生理鹽水恢復體積至500μL，過濾后上流式細胞儀檢測。

3實驗結果

3.1結腸損傷評分見表1。肉眼下可見模型組結腸粘膜明顯充血、水腫，中到重度糜爛和多個潰瘍，潰瘍呈圓形或橢圓形，底部干凈，或可見少量淡黃色覆蓋物，邊緣充血水腫；鏡下可見粘膜糜爛脫落、充血水腫，炎癥細胞浸潤，形成多個潰瘍缺損，結腸指數、結腸損傷評分及病理組織學評分明顯高于正常組(P<0.01)；各觀察組亦可見少量充血水腫和部分結腸可見輕度糜爛和潰瘍，鏡下可見潰瘍數目明顯減少，底部可見纖維結締組織增生，充血水腫明顯減輕，伴少量炎癥細胞浸潤，與模型組比較結腸指數、結腸損傷評分及病理組織學評分明顯下降并具有統計學意義(P<0.01或P<0.05)。提示當歸多糖各劑量組可明顯緩解結腸損傷局部充血水腫，減輕炎癥細胞浸潤程度，減少潰瘍數目，促進結腸上皮損傷修復、潰瘍愈合。

表1　結腸粘膜損傷修復情況

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01，#P<0.05。

3.2小腸粘膜PP結淋巴細胞亞群表達水平見表2。與正常組比較，模型組小鼠腸道PP結淋巴細胞中CD3+T淋巴細胞數量明顯下降，并具有統計學意義(P<0.05)，而CD4+T細胞有上升趨勢，CD8+T細胞有下降趨勢，不過其二者比值(CD4/CD8)顯著下降(P<0.01)。與模型組比較，各觀察組對CD3+T淋巴細胞作用不明顯，均可明顯下調CD4+、CD8+T細胞水平，高劑量組及柳氮磺吡啶對照組可使CD4/CD8升高，并具有顯著性統計學意義(P<0.05或P<0.01)。

表2　小腸PP結淋巴細胞亞群水平

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

4討論

性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一組病因不明的慢性腸道炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結腸炎和克隆病，目前普遍認為IBD的產生主要來自于黏膜免疫、相關基因和環境因素，效應T細胞的活化是腸黏膜免疫及其后續炎癥的起點，外周T細胞亞群中，已明確CD4+T細胞是導致腸黏膜炎癥的主要效應細胞。腸道共生的微生物抗原刺激腸黏膜T細胞，CD4+T細胞或非典型NKT細胞活化后，分泌IL-13，IL-4，IL-5等。腸黏膜免疫調節紊亂導致炎癥性腸病的發生，表現與潰瘍性結腸炎相似[5-6]。在本實驗中模型組大鼠外周血CD4+T細胞水平顯著升高正好印證了這一點。當歸多糖是當歸中的主要成分之一。現代藥理學表明，當歸多糖具有調節免疫系統、對血液循環系統、抗腫瘤、抗放射損傷等其他方面的作用[6]。當歸多糖作為免疫調節劑和抗放射損傷劑已應用于臨床，但治療潰瘍性結腸炎的臨床應用鮮見報道。實驗表明，當歸多糖可以通過降低大鼠潰瘍性結腸炎結腸損傷分數，顯著降低MDA、NO含量，MPO活性及IL-2、TNF-α水平SOD活性，升高TGF-β、IL-10水平，表明當歸多糖可通過拮抗氧化、免疫調節、損傷修復作用，緩解免疫性結腸炎大鼠炎癥反應，減輕結腸損傷[7]。正如本實驗的研究結果表明，當歸多糖給藥后小鼠結腸少量充血水腫和部分結腸可見輕度糜爛和潰瘍，鏡下可見潰瘍數目明顯減少，底部可見纖維結締組織增生，充血水腫明顯減輕，伴少量炎癥細胞浸潤，病理損傷評分明顯下降，提示當歸多糖可有效治療小鼠潰瘍性結腸炎，同時當歸多糖在一定的劑量下，可明顯下調PP結中CD4+、CD8+T細胞水平，下調CD4/CD8水平，表明當歸多糖可能是通過明顯調節腸道粘膜免疫系統T淋巴細胞亞群平衡，恢復免疫耐受狀態，進而防止或降低致炎因子的分泌或高表達，減輕炎性損傷，從而治療潰瘍性結腸炎。當然，當歸多糖調節腸道粘膜免疫細胞平衡的分子基礎未得到很好的詮釋，是否和T淋巴細胞的活化，活化的途徑，與抗原遞呈細胞活化相關性等等并不清楚，還有待于進一步的深入研究。

參考文獻

[1]石忠峰,陳蔚文,李茹柳,等.白術黃芪湯及其有效部位組方對小鼠潰瘍性結腸炎的療效觀察[J].中藥新藥與臨床藥理,2007,18(2):87-90.

[2]朱峰,錢家鳴,潘國宗.細胞免疫反應性炎癥性腸病動物模型的建立[J].中國醫學科學院學報,1998,20(4):271-277.

[3]Dielman LA, Palmen AJ, Akol H, et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines[J].Clin Exp Immunol,1998,114(3):385-391.

[4]范駿.腸道黏膜免疫[J].國隧魚疫學雜志,2006,29(2):111-115.

[5]王旭丹,袁學勤.腸黏膜免疫調節紊亂介導炎癥性腸病的發生[J].世界華人消化雜志,2005,13(18):2 257-2 262.

[6]Heller F, Fuss IJ, Nieuwenhuis E, et al. Oxazolone colitis, a Th2 colitis model resembling ulcerative colitis, is mediated by IL-13 producing NK-T cells[J].Immunity,2002,17:629-638.

[7]胡小平,李玉云,李先何,等.當歸多糖的成分及藥理學研究新進[J].中藥材,2004,27(1):70-72.

[8]劉少平,董衛國,吳東方,等.當歸多糖對免疫性結腸炎大鼠結腸損傷的保護作用研究[J].中國藥理學通報,2003,19(6):693-696.

收稿日期：(2015-06-22)編輯：翟興英

中圖分類號：R285.5

文獻標識碼：B

通信作者：**趙海梅(1979—)，女，博士，副教授。研究方向：中醫臨床基礎。Tel:0791-86588407，E-mail:haimei79@163.com。