自擬通痹湯對實驗性關節(jié)炎小鼠的免疫調節(jié)作用

★　楊軍平　(江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院　南昌 330006)

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自擬通痹湯對實驗性關節(jié)炎小鼠的免疫調節(jié)作用

★楊軍平(江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院南昌 330006)

摘要：目的：研究自擬通痹湯對實驗性關節(jié)炎小鼠單核吞噬細胞系統(tǒng)的吞噬功能、脾細胞抗體生成及遲發(fā)性變態(tài)反應的影響，探討自擬通痹湯治療類風濕關節(jié)炎的機理。方法：從吞噬指數(shù)K值和吞噬系數(shù)α值，脾細胞抗體生成的量，耳腫脹值及胸腺指數(shù)探討自擬通痹湯對類風濕關節(jié)炎小鼠免疫調節(jié)的變化。結果：自擬通痹湯給藥組的吞噬指數(shù)K值和吞噬系數(shù)α值與模型組比較無顯著性差異；自擬通痹湯給藥組的脾細胞抗體生成量與模型組相比有顯著性差異(P<0.05)；自擬通痹湯高劑量組耳腫脹值與模型組相比有顯著性差異(P<0.01)。結論：自擬通痹湯能降低實驗性關節(jié)炎小鼠脾細胞抗體生成的量,抑制遲發(fā)型變態(tài)反應，從而調節(jié)其免疫功能。

關鍵詞：自擬通痹湯；類風濕性關節(jié)炎；免疫功能

類風濕關節(jié)炎(RA)是一種以滑膜組織炎性改變?yōu)橹鞯淖陨砻庖咝约膊。浒l(fā)病原因可能與遺傳、感染及性激素等有關。RA的病理變化是滑膜組織的炎癥反應加劇,形成血管翳侵入并破壞軟骨，侵蝕軟骨下骨組織,最終導致骨關節(jié)結構破壞[1-2]。

自擬通痹湯是我院喻建平主任的臨床經(jīng)驗方，由通痹風藤、虎杖、羌獨活、寒水石等組成。自擬通痹湯具有清熱祛風除濕、消腫止痛之功效，適用于類風濕關節(jié)炎濕熱痹阻證[3]。自擬通痹湯經(jīng)多年臨床應用,療效顯著。本研究從動物實驗角度，觀察自擬通痹湯對實驗性關節(jié)炎小鼠的免疫調節(jié)的影響，探討中藥治療類風濕關節(jié)炎的機理。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物10個月齡昆明種小鼠(由江西中醫(yī)藥大學動物中心提供)，二級，體重(20±1)g，雌雄各半，明暗為自然光線，室溫(24±1)℃、濕度50%±5%，適應環(huán)境一周。適應期動物可自由攝食和飲水。動物合格證號為：2012-021。

1.1.2主要儀器電子分析天平(型號：XS105DU,瑞士梅特勒托利多進口電子分析天平廠家)；超級恒溫箱(規(guī)格型號：501-A，深圳市寶域科技有限公司)；紫外可見分光光度計(型號：7230G,上海天普分析儀器有限公司)；低溫離心機(型號：ALLegra X-15R，美國貝克曼庫爾特有限公司)。

1.1.3主要試劑和實驗藥物2，4二硝基氟苯(DNFB)，上海士鋒生物科技有限公司，批號950411，分析純。綿羊紅細胞，實驗室制備。自擬通痹湯:配制成生藥粉,由江西省中醫(yī)院制劑研究室提供，批號121104。強的松：浙江仙琚制藥股份有限公司，批準文號：國藥準字H33021207，批號1206018。濕熱痹顆粒：遼寧好護士藥業(yè)(集團)有限責任公司，批準文號：國藥準字Z21021523，批號20121201。

1.2方法

1.2.1單核吞噬細胞系統(tǒng)的吞噬功能昆明小鼠60只，體重(20±1)g，雌雄各半，動物稱重后按組放置不同的實驗間，分籠喂養(yǎng)。采用隨機法隨機分為六組:模型對照組、西藥對照組、中藥對照組、自擬通痹湯高劑量給藥組、自擬通痹湯中劑量給藥組、自擬通痹湯低劑量給藥組，每組10只。分組后模型對照組給予等體積的蒸餾水，其余各組按不同劑量灌胃給藥，每天1次，連續(xù)14d。在末次給藥1h后，從尾靜脈注射印度墨汁，每只注射0.1mL，分別在注射1min、5min后取血20μL，分別加到2mL的0.1%碳酸鈉溶液中,輕輕搖勻，測吸光度值(650nm波長)；小鼠處死后，在冰面上迅速取出肝臟、脾臟，稱重。

計算公式：

1.2.2脾細胞抗體生成昆明小鼠60只，體重(20±1)g，雌性，動物稱重后按組放置不同的實驗間。采用隨機法隨機分為六組:模型對照組、西藥對照組、中藥對照組、自擬通痹湯高劑量給藥組、自擬通痹湯中劑量給藥組、自擬通痹湯低劑量給藥組，每組10只。分組后模型對照組給予等體積的蒸餾水，其余各組按不同劑量灌胃給藥，每天1次，連續(xù)14d。

綿羊紅細胞的制備：脫纖維防凝處理的綿羊血，加入適量生理鹽水混勻，2000r·min-1離心5min，棄上清，再加入適量的生理鹽水混勻，2000r·min-1離5min，棄上清，利用生理鹽水分別配制成不同濃度。

補體制備:綿羊紅細胞1mL加到5mL的豚鼠血清中，放置4℃環(huán)境下,不停振蕩30分鐘，1500 r·min-1，離心20min,分離的血清保存在-70℃超低溫冰箱。使用時血清用PBS緩沖液1∶10進行稀釋。給藥第10d開始，每組動物腹腔注射2%綿羊紅細胞，注射量為0.2mL。給藥第14日后，既小鼠免疫4天后,小鼠股動脈取血，處死，勻漿脾臟，細胞濃度調整至2×107mL-1，PBS緩沖液洗。把各1mL的細胞懸液、0.2%綿羊紅細胞、補體混合在一起，組成混合液，37℃環(huán)境放置1小時。1500r·min-1，離心20min,取上清液，測吸光度值(波長540nm)。

1.2.3小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應昆明小鼠70只，體重(20±1)g，雌雄各半，動物稱重后按組放置不同的實驗間。采用隨機法隨機分為七組:正常對照組、模型對照組、西藥對照組、中藥對照組、自擬通痹湯高劑量給藥組、自擬通痹湯中劑量給藥組、自擬通痹湯低劑量給藥組，每組10只。分組后正常對照組、模型對照組給予等體積的蒸餾水，其余各組按劑量灌胃給藥，每天1次，連續(xù)14d。

正常對照組外，其余各組小鼠腹部去毛，面積大小約為3cm×3cm，然后將1%二硝基氟苯溶液輕輕地擦拭在去毛范圍處，每日涂抹1次,進行致敏。致敏到第5d，將10μL 1%二硝基氟苯溶液均勻擦拭在小鼠左耳朵(正反面),并對小鼠進行攻擊。攻擊24h后，處死小鼠，分別剪下小鼠的兩只耳殼，用打孔器打出耳片,直徑約8mm，并稱重。同時在冰面上迅速取出小鼠胸腺及脾臟，稱重并計算臟器指數(shù)=臟器重量/小鼠體重(mg·g-1)；以兩耳片重量的差值為耳腫脹值。

2結果

2.1自擬通痹湯對小鼠單核吞噬細胞系統(tǒng)吞噬功能的影響見表1。

表1　自擬通痹湯對小鼠單核

注：與模型對照組相比，*P<0.05。

通痹各劑量給藥組吞噬指數(shù)K值和吞噬系數(shù)α值與模型對照組相比均無顯著性差異(P>0.05)，而西藥對照組的吞噬指數(shù)K值與模型對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。

2.2自擬通痹湯對小鼠脾細胞抗體生成的影響見表2。

表2　自擬通痹湯對小鼠脾細胞抗體生成的影響±s,n=10)

注：與模型對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

自擬通痹湯給藥各組吸光度值與模型組相比有顯著性差異(P<0.05)，西藥對照組和中藥對照組吸光度值與模型對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。

2.3自擬通痹湯對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應的影響見表3。

表3　自擬通痹湯對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應的影響±s,n=10)

注：與正常對照組相比，▲▲P<0.01,與模型對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

模型對照組小鼠耳腫脹值與正常對照組相比有顯著性差異(P<0.01)，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)與正常對照組相比有顯著性差異(P<0.01)；自擬通痹湯高劑量給藥組耳腫脹值與模型組相比有顯著性差異(P<0.01)，西藥對照組和中藥對照組耳腫脹值與模型對照組相比有顯著性差異(P<0.01)，自擬通痹湯中、低劑量給藥組與模型對照組相比無顯著性差異(P>0.05)；西藥對照組、中藥對照組胸腺指數(shù)與模型對照組相比有顯著性差異(P<0.01)；自擬通痹湯高劑量給藥組、西藥對照組、中藥對照組脾臟指數(shù)與模型對照組相比有顯著差異(P<0.01)。

3討論

類風濕關節(jié)炎是一種以慢性進行性關節(jié)病變?yōu)橹鞯淖陨砻庖咝约膊。P節(jié)受累主要表現(xiàn)為滑膜炎癥、滲出、細胞增殖以及肉芽腫形成，當關節(jié)累及軟骨或骨質時造成軟骨及骨組織破壞，導致關節(jié)強直及其功能障礙。

類風濕性關節(jié)炎發(fā)病主要是由細胞免疫系統(tǒng)與體液免疫系統(tǒng)兩方面的紊亂所造成的，它涉及到多形核細胞、血管內皮細胞、淋巴細胞、單核-巨噬細胞等，以及細胞因子與炎性介質。我們分別從網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)的吞噬功能、特異性脾細胞抗體生成和遲發(fā)型超敏反應三方面探討自擬通痹湯對實驗性關節(jié)炎小鼠免疫調節(jié)作用的機理。

網(wǎng)狀內皮細胞系統(tǒng)的細胞具有很強的吞噬能力,能吞噬異物、細菌以及衰老與突變的細胞。它包括巨噬細胞、淋巴細胞、粒細胞以及肥大細胞。而吞噬殺傷作用可被補體的免疫粘附作用、特異性免疫中抗體的調理作用及細胞因子所加強。巨噬細胞與T淋巴細胞的表面協(xié)同刺激分子受體產(chǎn)生協(xié)同刺激信號，誘導T淋巴細胞活化，從而啟動免疫應答。在免疫應答的起始反應階段，巨噬細胞通過處理抗原物質、分泌IL-1、激活淋巴細胞來促進淋巴細胞的分裂與分化；在免疫應答的效應反應階段，巨噬細胞集聚在病灶周圍，在淋巴因子的激活作用下，發(fā)揮巨噬細胞的屏障功能[4-5]。從表1可見,自擬通痹湯對小鼠網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)的吞噬功能無明顯影響。

機體的特異性體液免疫應答主要是由B淋巴細胞介導，外來的抗原物質進入機體后誘導B淋巴細胞活化并產(chǎn)生特異性的抗體，發(fā)揮重要的體液免疫作用。我們通過檢測B淋巴細胞活化產(chǎn)生的特異性抗體的水平來判斷B淋巴細胞的功能。將經(jīng)綿羊紅細胞免疫后的小鼠脾細胞與一定量的綿羊紅細胞混合，在補體參與作用下，產(chǎn)生特異性抗體。檢測特異性抗體水平的指標是測量脾細胞周圍結合了抗體分子的羊紅細胞所溶解后形成的溶血空斑。溶血空斑的大小表示脾細胞抗體形成量的多少[4-5]。從表2可知，自擬通痹湯能明顯降低綿羊紅細胞致敏的脾細胞抗體形成量，明顯抑制體液免疫應答。

遲發(fā)型超敏反應的發(fā)生與吞噬細胞、效應T細胞、細胞毒性介質等密切相關。這是由于效應T細胞作用于相應的抗原后，出現(xiàn)了細胞浸潤和組織損傷等炎癥反應的重要形態(tài)特征[4-5]。從實驗結果可以看出,自擬通痹湯對二硝基氟苯誘導的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應有明顯的抑制作用,對特異性細胞免疫有抑制作用。

本研究表明自擬通痹湯只對體液免疫和細胞免疫起作用,對非特異性屏障機能不產(chǎn)生影響，這充分說明該治療類風濕性關節(jié)炎的藥物是非常有臨床價值的。因此，在臨床應用時，自擬通痹湯對治療類風濕性關節(jié)炎既可起到針對性的治療效果，又可避免因廣泛的免疫抑制變化而出現(xiàn)的毒副作用。同時闡明自擬通痹湯對實驗性小鼠類風濕性關節(jié)炎免疫調節(jié)作用，為該藥清熱除濕、消腫止痛的免疫調節(jié)機制提供理論依據(jù)。

參考文獻

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[3]楊軍平,邱麗瑛,肖亮,等.自擬通痹湯對II型膠原性關節(jié)炎關節(jié)軟骨的作用[J].中國組織工程研究,2012,16(42):7 843-7 848.

[4]張赟,溫偉紅.細胞和分子免疫學實用實驗技術[M].北京：第四軍醫(yī)大學出版社,2013.

[5]何維.醫(yī)學免疫學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2010.

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收稿日期：(2015-07-11)編輯：翟興英

中圖分類號：R285.5

文獻標識碼：B