基于蛋白質組學的附子、干姜和花椒的性味研究

王秋紅 楊 欣 李雪磊 楊炳友 王艷宏 匡海學

(教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質基礎研究重點實驗室，黑龍江中醫藥大學，哈爾濱，150040)

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基于蛋白質組學的附子、干姜和花椒的性味研究

王秋紅 楊 欣 李雪磊 楊炳友 王艷宏 匡海學

(教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質基礎研究重點實驗室，黑龍江中醫藥大學，哈爾濱，150040)

目的：探討溫熱中藥(附子、干姜、花椒)對正常大鼠能量代謝及相關蛋白表達的影響，探索溫熱中藥在性味—功效—藥理作用上的共性和差異性，為闡明溫熱中藥性味的科學內涵提供依據。方法：選擇Sprague Dawley(SD)雌雄大鼠，給藥21 d后，大鼠通過腹腔內注射1%戊巴比妥鈉麻醉(每100 g體重0.15 mL)，差速離心法提取蛋白，BCA蛋白定量和SDS-PAGE檢測蛋白完整性，應用同位素標記相對和絕對定量(iTRAQ)技術結合2D LC-MS/MS篩選肝臟中的差異蛋白。結果：與空白對照組相比，溫熱中藥(附子、干姜、花椒)共篩選出50個共有差異蛋白，其中11個差異蛋白在肝臟中低表達，39個差異蛋白在肝臟中高表達，50個共有差異蛋白主要分布在18個通路中，其中絕大多數與能量代謝相關。結論：附子、干姜、花椒等熱性中藥在蛋白質組學方面存在共性和差異性，這種共性不僅體現在物質代謝和能量代謝上，也體現在其他藥理作用上，其中，主要是通過增加體內熱量生成和提高對能量的利用兩個方面影響機體的能量代謝。研究結果為以“中藥同時具有性(氣)與味，性(氣)與味是中藥(包括方劑、單味中藥、有效部位或組分、單體化合物)同時兼具的兩種特性。藥味與藥物的具體功效相關。藥性(氣)是藥物通過不同途徑以主要影響機體的能量代謝、物質代謝為特征的，可影響藥物療效發揮或與副作用發生有關的一類生物學效應。”的中藥性味理論新假說的客觀性提供了科學依據，同時為評價中藥寒熱藥性提供了新的方法。

附子；干姜；花椒；中藥性味；寒熱藥性；能量代謝；藥理作用；蛋白質組學

中藥藥性理論研究，特別是中藥四性科學內涵的解析是目前中醫藥研究難點和重點領域。中藥具有的四性(氣)，即寒、熱、溫、涼是中藥的基本特性。中藥四性中的溫和熱，寒和涼在本質上并沒有差別，只是程度上有所不同。中醫認為的寒熱藥性是根據臨床經驗和反復驗證歸納總結所得，是對藥物療效作用的高度概括，臨床上運用藥物四氣治療疾病，主要是根據藥物的寒、熱、溫、涼之偏性，治療疾病的寒和熱，從而使人體達到相對平衡狀態[1-4]。西藥雖然具有物質結構明確、作用機理清晰的優勢，卻由于沒有標示其寒熱藥性，因此不能向中藥一樣在臨床上辨證用藥，因此，中藥的四性也是中藥有別于西藥的最本質的特征。迄今，諸多不同學科的研究者應用各種不同的研究方法，從機體功能的多個方面如神經系統、內分泌系統、能量代謝等，對中藥四性開展了大量的探索性研究，盡管證實一些溫熱藥可以提高機體的基礎代謝率，或對內分泌系統、中樞和植物神經系統有興奮作用[5-7]，但是仍還沒有建立完整的體系詮釋全部中藥的寒熱藥性的科學內涵。在中藥四性的研究方法方面，國內研究者雖然采用了諸多現代科學技術前沿的研究方法，但還沒有建立起適于中藥復雜體系與特點的、能對藥性、藥味的科學內涵進行科學解析的有效途徑及方法[8-10]。

本課題組匡海學教授提出了中藥性(氣)味科學內涵的新假說，即“中藥同時具有性(氣)與味，性(氣)與味是中藥(包括方劑、單味中藥、有效部位或組分、單體化合物)同時兼具的兩種特性。藥味與藥物的具體功效相關。藥性(氣)是藥物通過不同途徑以主要影響機體的能量代謝、物質代謝為特征的，可影響藥物療效發揮或與副作用發生有關的一類生物學效應。促進機體能量代謝、物質代謝的中藥具有熱(或溫)性，抑制機體能量代謝、物質代謝的中藥具有寒(或涼)性。藥性(氣)可以通過動物實驗以及系統生物學等方法予以評價歸屬。中藥一味一性，一藥內部X味Y性(Y≤X)”。本文依據匡海學教授的這個科學假說，并采用蛋白質組學的研究方法，選擇代表性的溫熱中藥附子、干姜和花椒，在蛋白質水平上開展藥性、藥味的實驗研究，探討溫熱中藥在藥性和藥味中存在共性和差異性，為進一步驗證匡海學教授提出的中藥藥性科學內涵新假說的客觀性提供依據，也為完善中藥寒熱藥性的評價方法進行有益的探索。

1 材料與動物處理

1.1 實驗藥品 所選用的附子、干姜、花椒購買于哈爾濱世一堂藥店，經黑龍江中醫藥大學中藥鑒定學教研室都曉偉教授鑒定符合2010版《中華人民共和國藥典》相關規定。

1.2 實驗試劑 iTRAQ? Reagents Multiplex Kit(Applied Biosystem)；iTRAQ? Reagents Application Kit-Plasma(Applied Biosystem)；乙腈(Fisher Scientific)；甲醇(Fisher Scientific)；BCA Protein Assay Kit(康為世紀)；組織蛋白提取試劑盒(康為世紀)；SDS凝膠試劑盒(康為世紀)；考馬斯亮藍染料G250(Amesco)；雙蒸水為本實驗室用MilliQ純水儀制備；乙醇(Fisher Scientific)；甲酸(Fisher Scientific)；胰蛋白酶(Promega)；Durashell-C18(Agela)；10K超濾管(100個/Pack，Sartorious)；strata-X C18除鹽柱(phenomenex)；進樣瓶(Agilent，5183-2072)；瓶蓋(Agilent，5185-5829)；內稱管(Agilent，5182-0549)；噴針(New Objective，PN：FS360-20-10-N-20-C12)。

1.3 中藥水煎液的制備 按臨床常用方法對藥物進行處理。稱取定量的上述藥材，加入10倍量水，浸泡60 min，快速加熱至沸騰，煎煮60 min，傾出藥液，殘渣再加入8倍水，煎煮提取60 min。合并2次藥液，濾過，附子、干姜、花椒分別濃縮至含生藥量為0.53 g/mL、0.42 g/mL、0.20 g/mL的中藥水提液，4 ℃儲存備用。

1.4 實驗動物分組及給藥 雌性SD大鼠40只，體重(180±20) g，購自黑龍江中醫藥大學醫學實驗動物中心，合格證號：SCXK黑2014007，置動物籠飼養，保持室內溫度18～22 ℃，室內晝夜自然明暗交替照明，飼養標準大鼠飼料。將大鼠隨機分為4組，空白對照組、附子組、干姜組和花椒組，每組各10只。大鼠在動物飼養室適應7 d后，各給藥組劑量均為臨床人用高限劑量的42倍，每天分別按給藥容積為20 mL/kg體重連續灌胃生理鹽水和附子(10.5 g/kg)、干姜(8.4 g/kg)、花椒(4.0 g/kg)水煎液21 d，各組飼養過程中保持溫度、光照、濕度等環境條件均衡，自由進食飲水。

2 實驗方法

2.1 樣品處理 給藥21 d后，大鼠通過腹腔內注射1%戊巴比妥鈉麻醉(每100 g體重0.15 mL)，迅速打開腹腔，從門靜脈注射冰冷的生理鹽水，清除殘留血液，取出肝臟，用冰冷緩沖液洗凈，去除肝臟表面的血液，用濾紙吸干表面液體，稱重。蛋白提取采用組織蛋白抽提試劑盒(康為世紀：CW0891)，取0.1 g大鼠肝臟組織，用液氮研磨能細末，轉入離心管中；取990 L的蛋白抽提試劑，加入10 L的蛋白酶抑制劑，蛋白酶抑制混合物在進行蛋白抽提前2 min內加入；冰上孵育20 min；10 000×g離心20 min；收集上清，在-80 ℃保存備用。提取的蛋白采用BCA(Bicin-choninic Acid)蛋白定量試劑盒(康為世紀：CW0014)進行蛋白定量，在分光光度計在562 nm處測定每個樣品及BSA標準品的吸光值，繪制標準曲線時X軸(縱坐標)為蛋白的質量濃度μg/μL，Y軸(縱坐標)為吸光值。用excel制作標準曲線，計算樣品中的蛋白含量。蛋白完整性采用SDS-PAGE凝膠試劑盒(Beyotime biotechnology，China)，分離膠濃度10%，濃縮膠濃度5%，凝膠厚度為1 mm，考馬斯亮藍快速染色(G250)方法進行凝膠染色，染色后的凝膠用BIO-RAD掃描儀進行掃描，重復3次，并利用Image Lab 4.0.1軟件進行圖像分析。

2.2 樣品酶解實驗步驟 蛋白定量后取100 μg蛋白溶液置于離心管中；加入4 μL Reducing Reagent，37度反應1 h；加入2 μL Cysteine-Blocking Reagent，室溫10 min；將還原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超濾管中，12 000轉離心20 min，棄掉收集管底部溶液；加入iTRAQ?試劑盒中的Dissolution Buffer 100 μL，12 000轉離心20 min，棄掉收集管底部溶液，重復3次；更換新的收集管，在超濾管中加入胰蛋白酶，總量2～4 μg，37 ℃反應過夜；次日，12 000轉離心20 min，酶解消化后的肽段溶液離心于收集管底部；在超濾管中加入50 μL Dissolution Buffer，12 000轉離心20 min，與上步合并，收集管底部共得到150 μL酶解后的樣品。

2.3 標記步驟 從冰箱中取出iTRAQ?試劑，平衡到室溫，將iTRAQ?試劑離心至管底；向每管iTRAQ?試劑中加入200 μL乙醇，渦旋振蕩；取75 μL樣品(100 μg酶解產物)轉移到新的離心管中；將iTRAQ?試劑填加到樣品中，空白組：114，附子組：115，干姜組：116，花椒組：117。渦旋振蕩，室溫反應2 h；加入100 μL水終止反應；混合標記后的樣品，渦旋振蕩；真空冷凍離心干燥；抽干后的樣品冷凍保存待用。

2.4 高pH反相分級 流動相A(pH=10 2% ACN，0.1% FA)。流動相B(20 mM Ammonium formate(pH=10),80%ACN)。將標記抽干后的樣品用150 μL流動相A復溶，渦旋振蕩，12 000轉離心20 min，吸取上清供檢測，進樣量100 μL；準備46個空白1.5 mL離心管，依次標記為1-46，用于收集分離得到的組份1-46；流速0.8 mL/min；分離梯度為0—6 min，5%B;6—6.1 min,5%～8%B;6.1—30 min,8%～30%B;30—39 min,30%～50%B;39—40 min,50%～80%B;40—44 min,80%B;44—45 min,80～5% B;45—55 min，5%B。從第5 min開始，收集每分鐘的洗脫物依次到1-46號離心管中；真空冷凍離心干燥；抽干后的樣品冷凍保存待用。

2.5 納升級反相色譜-TripleTOFTM 5600進行蛋白質分析 根據紫外監測情況，將高pH反相分離得到的46個組分合并為10個組分，合并時采用30 μL 2% ACN，0.1% FA，加入第一個離心管，渦旋振蕩并離心后，轉入第二個離心管，依次直至合并組分最后一管；12 000轉離心10 min，吸取上清上樣；上樣體積8 μL，采取夾心法上樣；流動相A(2%ACN+0.1%FA)，流動相B(98%ACN+0.1%FA);Loading Pump流速2 μL/min，15 min,流動相A；gradient1分離流速0.3 μL/min,流動相為A,B;洗脫梯度為0—0.1 min,5%～8%B;0.1—60 min，8%～27%B;60—74.9 min，27%～50%B;74.9—75 min，50%～80% B;75—80 min，80%B;80—80.5 min，80%～5% B;80.5—90 min,5%B。質譜參數設置：源氣參數：Ion spray voltage：2.3 kv；GS1：3；Curtain gas：30或35；DP：100或80；TOF MS：m/z：350-1250；accumulation time：0.25 s；product ion scan：IDA mumber：30；m/z：100-1500；accumulation time：0.1 s；Dynamic exclusion time：25 s；Rolling CE：enabled；Adjust CE when using iTRAQ? reagent：enabled；CES：5。

2.6 數據庫搜索 采用ProteinPilotTM4.5和DAVID Bioinformatics Resources 6.7鑒定差異蛋白和差異蛋白代謝通路分析。Cytoscape 3.2.0、IntAct[11]和MINT[12]對差異蛋白進行蛋白相互作用分析。

3 實驗結果

3.1 2D LC-MS/MS定量肝臟共有差異蛋白 采用ProteinPilotTM Software 4.5篩選鑒定出差異蛋白，ProteinPilotTM Software軟件操作簡單，簡化蛋白鑒定和定量的過程，可以同時鑒定成百上千的肽段修飾和非胰酶的斷裂；方便地區分蛋白異構體、蛋白亞群，抑制蛋白鑒定假陽性結果；并以可視化方式明確展現肽段—蛋白之間的相互關聯。篩選的差異表達的蛋白需同時滿足下列條件：在兩次技術重復中均被鑒定為差異蛋白質；蛋白的鑒定基于兩個或兩個以上特異性肽段；蛋白的差異在兩次實驗中的蛋白質平均變化比率上調1.2倍以上或者下調0.6倍以上。在肝臟中共鑒定出2 047個蛋白。依據上述要求，附子、干姜、花椒與空白組比較鑒定出50個差異蛋白，下調11個差異蛋白，上調39個差異蛋白。詳見表1。

表1 附子、干姜、花椒與空白對照組比較共有差異蛋白

注：↑：差異蛋白在肝臟中高表達，↓：差異蛋白在肝臟中低表達。

3.2 附子、干姜、花椒共有差異蛋白的藥理作用分析 中藥藥性是中醫基礎理論的核心，藥理作用是藥物發揮作用效果的高度概括和總結，藥性和藥理作用相互影響，是將中醫和西醫聯系的有效方法，也是揭示中藥藥性本質的有效手段。中藥藥性理論研究的最佳方法是基于中藥藥理作用。研究藥性在藥理作用方面的特性和規律性，具有一定的典型性和示范性。本研究以中藥藥性、藥效及能量代謝的相關性為主，將中藥傳統理論與蛋白質組學成果聯系起來，在蛋白質組學方面建立符合中醫藥思想的中藥藥性組方體系[13-14]。

附子、干姜、花椒，三者性味皆辛熱，均具有溫里散寒之功，這是主要共同點。綜合現代藥理學研究報道可知，附子、干姜、花椒共有的藥理作用包括抗腫瘤、抗衰老、鎮痛、抗炎、保肝、對心血管系統的作用等[15-17]。本文從附子、干姜、花椒共篩選出50個共有、且作用趨向一致的差異蛋白，首先采用Uniprot(http://www.uniprot.org/)數據庫確認蛋白功能，并通過網絡可視化和分析軟件Cytoscape聯合差異蛋白文獻將差異蛋白進行系統地歸納分析。如圖1。

3.2.1 附子、干姜、花椒的抗腫瘤作用 本次研究發現大鼠灌胃給予附子、干姜、花椒水煎液后，與抗腫瘤相關的蛋白谷胱甘肽過氧化物酶l、糖原磷酸化酶、碳酸酐酶1、碳酸酐酶3表達上調。目前，GSH-Px至少有4種同工酶，谷胱甘肽過氧化物酶l[18](GPXl)是谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)家族中的重要成員之一。廣泛分布于機體各個組織，主要功能是將脂質過氧化物和過氧化氫催化分解成相應的醛類和水，許多研究顯示在動脈粥樣硬化、血管壁抗氧化應激和肝癌中GPX1發揮主要作用。研究表明：GSH-Px在肝癌組織表達明顯降低。碳酸酐酶[19-20](carbonic anhydrase，CA)廣泛存在哺乳動物中，幾乎各個組織中都可以檢測到CA的存在，CA機體的生理過程和物質代謝發揮重要作用，如生理過程的酸堿平衡、骨吸收、唾液和胃酸的形成等，以及物質代謝中的尿素生成、糖異生和脂肪生成等。CA與癌癥的發生和發展密切相關，隨著腫瘤病理機制不斷深入的研究，碳酸酐酶與腫瘤的關系已成為研究的熱點。CA1、CA2、CA3在肝癌組織中表達下調，能促進腫瘤細胞的生長和轉移。糖原磷酸化酶[21]Glycogen phosphorylase，GP)是糖原代謝過程中的關鍵酶，在糖原分解反應的第一步CP利用無機磷酸鹽將糖原轉化為1-磷酸葡萄糖。主要包括亞型即肌型(Muscle-type GP，PYGM)、肝型(Liver-type GP，PYGL)與腦型(Brain-type GP，BGP或PYGB)三種亞型，PYGL在調節細胞死亡上發揮主要作用，在增殖快、分化差的肝癌細胞系中PYGL的表達缺失或降低。已有文獻證明附子、干姜、花椒具有抗腫瘤作用[22-24]。本實驗可見附子、干姜、花椒能誘導谷胱甘肽過氧化物酶l、糖原磷酸化酶、碳酸酐酶1、碳酸酐酶3的表達上調，與三者均具有抗腫瘤作用相一致，同時表明這可能是抑制腫瘤作用的分子學機制之一。

3.2.2 附子、干姜、花椒的抗衰老作用 細胞衰老是個復雜而漸進的過程。它是指細胞在外在微環境變化或內在特定基因表達與失活等因素作用下脫離細胞周期，并不可逆地喪失增殖能力后進入的一種相對穩定狀態。引起細胞衰老的因素很多，具有綜合性和復雜性。實驗研究發現酰基CoA合成酶[25]在老年大鼠肝臟組織中表達減少，可能與脂質代謝異常調節相關。細胞衰老時，游離脂肪酸增多，對細胞損害增加，脂的降解能清除有害的游離脂肪酸，使這些降解的脂肪酸重新進入到合成途徑中。我們研究發現附子、干姜、花椒可以上調酰基CoA合成酶起到抗衰老的作用。這與文獻報道附子、干姜、花椒抗衰老機制一致[26-28]。

3.2.3 附子、干姜、花椒的鎮痛、抗炎作用 本文研究發現大鼠灌胃給予附子、干姜、花椒水煎液后，與鎮痛、抗炎相關的羧酸酯酶1表達上調，兒茶酚-O-甲基轉移酶表達下調。羧酸酯酶1[29](Carboxylesterase1，CES1)是膽固醇酯水解酶家族成員之一，主要功能是將膽固醇酯水解成為游離膽固醇并且排出巨噬細胞，使泡沫細胞的形成減少。最近研究表明[30-31]：CES1對系統和脂肪組織的炎性反應有降低作用，使胰島素敏感性增強和糖耐量增加等作用。其中，CES1主要在肝臟中表達。大量研究表明：在感染和炎癥等病理狀態下，大多數藥物代謝酶在肝臟中的表達水平降低、活性下降，導致藥物清除率下降，進而引起血漿藥物濃度增高發生藥物毒性反應。兒茶酚-O-甲基轉移酶(catechol-O-methyltransferase,COMT)主要功能是滅活含有兒茶酚結構的神經遞質，在神經系統和機體組織內分布，文獻研究表明[30-31]，COMT抑制劑目前在臨床上主要協助治療帕金森病、抗抑郁、抗Ⅱ型精神失常和治療神經痛等疾病。已有文獻證明，附子、干姜、花椒都具有鎮痛[32-34]、抗炎[35-37]的作用，干姜的醚提物和水提物都具有顯著鎮痛抗炎作用。附子煎劑對急性炎癥模型有明顯抑制作用，同時對熱刺激所致小鼠疼痛有顯著抗炎鎮痛作用。實驗證明，花椒和青椒的水提液都有明顯的鎮痛作用。臨床上用花椒乙醚提取物或花椒揮發油作為口腔科的安撫劑，進行消炎止痛。結合藥理學研究的文獻報道結果，認為附子、干姜、花椒可能通過誘導羧酸酯酶1蛋白的表達發揮抗炎作用，通過下調兒茶酚-O-甲基轉移酶的表達而發揮鎮痛作用。三者下調兒茶酚-O-甲基轉移酶的表達，能否成為該酶的抑制劑，需要我們進一步實驗研究。

3.2.4 附子、干姜、花椒對心血管的作用 本文研究發現大鼠灌胃給予附子、干姜、花椒水煎液后，與心血管相關的蛋白質二硫鍵異構酶、O-肉堿棕櫚酰轉移酶Ⅱ表達上調，兒茶酚-O-甲基轉移酶表達下調。蛋白質二硫鍵異構酶[38](proteindisulfide isomerase,PDI)是氧化還原酶之一，主要功能包括促進二硫鍵的形成與異構化、促進蛋白質正常折疊與恢復未折疊和錯誤折疊等，參與眾多蛋白的合成、成熟，在人體健康與復雜機制的疾病中發揮重要作用。最近研究發現：缺血性心臟病是導致死逐年增加，合并糖尿病患者死亡率明顯增加。PDI在心臟病中發揮關鍵作用，PDI表達上調能降低心肌梗死面積，減少心肌細胞凋亡。O-肉堿棕櫚酰轉移酶Ⅱ[39](CPTⅡ)缺乏會導致機體出現心律失常，臨床主要表現為心率慢、心音低鈍，心電圖表現為房室傳導阻滯，藥物治療無效。多巴胺(DA)主要參與人體精神活動和調控椎體外系的運動功能。疾病的發生和發展都與多巴胺的增多和減少有關。但是DA代謝降解主要由兒茶酚-O-甲基轉移酶(COMT)完成。COMT抑制劑可以減慢DA的代謝，且可以延長左旋多巴(L-dopa)在體內的半衰期，達到治療由于DA減少的引起帕金森、抑郁等相關疾病[40]。附子、干姜、花椒在臨床上被廣泛應該在心血管相關疾病中[41-43]，本實驗篩選出的50個差異蛋白，其中蛋白質二硫鍵異構酶、兒茶酚-O-甲基轉移酶和O-肉堿棕櫚酰轉移酶Ⅱ在心血管中發揮重要作用。

3.2.5 附子、干姜、花椒的保肝作用 目前，附子、干姜、花椒對消化系統的作用主要表現在抗消化道潰瘍、保肝利膽、治療腹瀉等。本文研究發現大鼠灌胃給予附子、干姜、花椒水煎液后，與保肝相關的蛋白質丙氨酸轉氨酶在肝臟中低表達、谷胱甘肽過氧化物酶在肝臟中高表達。丙氨酸轉氨酶[44]又稱谷丙轉氨酶，是肝功能檢查中常用指標之一，主要分布在肝臟、心臟和骨骼肌，當肝細胞受到破壞損傷或壞死時，血液中的丙氨酸轉氨酶表達增高。因此，該酶是反映肝細胞受損程度最靈敏的指標。谷胱甘肽過氧化物酶[45](Glutathione peroxidase，GSH-Px)是機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶。肝臟是合成多種抗氧化酶的主要器官，機體氧應激時存在損傷肝臟，而肝臟受損后，合成抗氧化酶減少，進一步加重機體的氧化應激。脂質過氧化在眾多肝病的發病機制中起到重要作用，作為集體抗氧化預防重要部分的GSH-Px在肝臟中分布豐富，因此GSH-Px與各種肝病關系密切。文獻表明附子、干姜、花椒都具有保肝作用[46-48]，主要通過影響丙氨酸轉氨酶和谷胱甘肽過氧化物酶的表達達到保肝效果。

圖1 附子、干姜、花椒共有藥理作用與差異蛋白分析

3.3 附子、干姜、花椒對機體物質代謝和能量代謝的影響 采用DAVID數據庫對差異蛋白進行Pathway注釋，得到差異蛋白所參與的所有途徑，篩選出差異蛋白顯著參與的途徑。附子、干姜、花椒共有的50個共有差異蛋白，主要分布在與能量代謝相關的通路或途徑。進一步分析表明，附子、干姜、花椒主要是通過增加體內熱量生成和提高對能量的利用兩大方面影響機體的能量代謝。從能量供應的角度看，糖、脂及蛋白質三大營養素可以互相代替，并互相制約。由于糖、脂、蛋白質分解代有共同的通路，所以，任何一個供能物質的分解代謝占優勢，常能抑制和節約其他供能物質的降解。體內糖、脂、蛋白質和核酸等的代謝不是彼此獨立，而是相互關聯，它們通過共同的中間代謝物，三羧酸循環和生物氧化等聯成整體。三者之間可以互相轉變，當一種物質代謝障礙時可引起其他物質代謝的紊亂。詳見圖2。

本課題組在匡海學教授假說的支持下，早前已經完成典型的寒性中藥(黃連、黃芩、黃柏)和熱性中藥(附子、干姜、花椒)代謝組學的研究，為寒熱藥性理論的研究創建了一個新的方法學平臺。2011年，匡海學等[49]采用UPLC-QTOF-MS法、主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘-判別分析(OPLS-DA)法等技術，確定18個與能量代謝相關的內源性生物標志物。其中天冬氨酸、L-2氨基乙二酸、5-磷酸核糖、木酮糖等與能量代謝相關的生物標記物在附子、干姜、花椒中上調。天冬氨酸又稱天門冬氨酸，是一種α-氨基酸，天冬氨酸的L-異構物是20種蛋白胺基酸之一，即蛋白質的構造單位[50]。它是生物體內賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸等氨基酸及嘌呤、嘧啶堿基的合成前體。它可作為K+、Mg2+離子的載體向心肌輸送電解質，從而改善心肌收縮功能，同時降低氧消耗，在冠狀動脈循環障礙缺氧時，對心肌有保護作，它參與鳥氨酸循環，促進氧和二氧化碳生成尿素，降低血液中氮和二氧化碳的量，增強肝臟功能，消除疲勞，天冬氨酸主要參與氨基酸代謝影響機體的能量代謝；半乳糖是一種由六個碳和一個醛組成的單糖，歸類為醛糖和己糖。它常以D-半乳糖苷的形式存在于大腦和神經組織中，也是某些糖蛋白的重要成分，是由乳類食物中的乳糖水解而來，其代謝主要是通過半乳糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷轉移酶及其所催化的酶促反應轉變為葡萄糖而被利用，主要參與半乳糖代謝影響機體的能量代謝；6-磷酸葡萄糖醛酸和5-磷酸核糖是磷酸戊糖途徑的中間產物，5-磷酸核糖是嘌呤核苷酸合成的原料。磷酸戊糖途徑產生NADPH，作為供氫體，參與體內多種生物合成反應，包括脂肪酸、膽固醇和類固醇激素的生物合成[51]；木酮糖是一種戊酮糖。在生物體內L型與D型的木酮糖先還原成木糖醇，繼之再氧化而相互轉換。D-木酮糖與ATP反應生成D-木酮糖-5-磷酸而進入磷酸戊糖途徑。因此成為另一糖酵解途徑的磷酸戊糖途徑的重要的中間物；白三烯具有共軛三烯結構的二十碳不飽和酸，參與花生四烯酸代謝，白三烯在呼吸道的炎癥、誘導鼻過敏反應中發揮重要作用。這些代謝物主要參與氨基酸代謝、糖代謝、花生四烯酸代謝、磷酸戊糖途徑來影響機體的能量代謝。

本實驗差異蛋白共有18個代謝通路與能量代謝相關，其中糖代謝、磷酸戊糖途徑、氨基酸代謝等途徑與匡海學教授研究的代謝組學影響能量代謝途徑相一致，將代謝組學和蛋白質組學結果相結合，發現附子、干姜、花椒無論是大分子還是小分子都主要參與糖代謝、脂肪酸代謝、磷酸戊糖途徑、氨基酸代謝等途徑增加機體內熱量的生成，提高對能量的利用來影響機體的能量代謝。

3.3.1 附子、干姜、花椒增加機體內熱量生成 本文通過蛋白質組學研究發現，附子、干姜、花椒參與能量代謝的主要途徑如下。

丙酮酸代謝途徑[52]：丙酮酸是體內產生的三碳酮酸，它是糖酵解途徑的最終產物，在細胞漿中還原成乳酸供能，或進入線粒體內氧化生成乙酰CoA，進入三羧酸循環，被氧化成二氧化碳和水，完成葡萄糖的有氧氧化供能過程。因此，丙酮酸在三大營養物質的代謝聯系中起著重要的樞紐作用。本實驗研究表明：附子、干姜、花椒上調醛脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸羥激酶有影響丙酮酸代謝途徑，進而增加機體內熱量的生成。

三羧酸循環(Tricarboxylic Acid Cycle，TCA)途徑：TCA是主要的能量代謝途徑之一，大多數需氧生物體內存在的代謝途徑，不僅是糖類、脂類、氨基酸的最終代謝通路，也是糖類、脂類、氨基酸代謝之間關聯的樞紐中心。三羧酸循環另一重要功能是為其他合成代謝提供小分子前體。附子、干姜、花椒可以上調磷酸烯醇式丙酮酸羥激酶，加快三羧酸循環，增加體內熱量的生成。

淀粉-蔗糖代謝途徑：機體的各個方面都受到糖類的影響，其不僅能提供呼吸底物和中間代謝產物所需要的能量，還能適用于生命基礎物質的合成和生命物質的結構成分。糖原磷酸化酶[53](glycogen phosphoryl-ase)是催化糖原降(glycogen nolysis)的關鍵酶，該酶催化糖原的磷酸解，產生的葡萄糖-1-磷酸在磷酸葡萄糖變位酶催化下轉變成葡萄糖-6-磷酸，后者或是在葡萄精-6-磷酸酶催化下生成葡萄糖，為機體組織提供葡萄糖，或是直接進入無氧代謝和有氧代謝途徑以參與能量供應。附子、干姜、花椒可以上調糖原磷酸化酶、UDP-葡萄糖-6-脫氫酶影響淀粉-蔗糖代謝途徑，使體內熱量生成增加。

糖酵解/糖異生途徑[55]：糖異生作用和糖酵解作用是互相關聯和制約。其中一條途徑活躍時，另一途徑的活性就相應降低，磷酸果糖激酶(糖酵解)和果糖-1,6-二磷酸酶(糖異生)是調控作用的關鍵酶。當葡萄糖供應相對比較充足時，果糖-2,6-二磷酸作為細胞內的分子信號也處于相對高水平。它能活化糖酵解作用并抑制糖異生途徑。果糖-2,6-二磷酸受到破壞則引起果糖-1,6-二磷酸酶活性加強，從而加速糖異生作用。附子、干姜、花椒上調醛脫氫酶X、磷酸烯醇式丙酮酸羥激酶影響糖酵解/糖異生途徑，進而影響能量代謝。

脂肪酸代謝途徑[56]：脂肪酸是機體主要能量來源之一。脂肪酸在有氧的情況下，可以氧化分解為CO2和H2O，釋放大量能量，脂肪酸氧化最活躍的組織是肝臟和肌肉，其最主要的氧化形式是β-氧化。脂肪酸β-氧化過程中生成的乙酰CoA，乙酰CoA作為重要的中間化合物，不僅能進入三羧酸循環氧化供能，還是許多重要化合物(酮體、膽固醇和類固醇)合成的原料。附子、干姜、花椒上調O-肉堿棕櫚酰轉移酶2、醛脫氫酶X影響脂肪酸代謝途徑，增加熱量生成。

類固醇激素生物合成途徑[57]：甾體激素具有極重要的醫藥價值，在維持生命、調節性功能，對機體發展、免疫調節、皮膚疾病治療及生育控制方面有明確的作用。許多類固醇激素都有良好的調節糖代謝和水鹽代謝的功能。附子、干姜、花椒上調類固醇17-α-羥化酶、CYP4503A18、角鯊烯單加氧酶的表達，調控參與類固醇激素的合成，可促進激素轉化，減少其滅活和排泄。

過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)途徑[66-68]：為核受體超家族之一，主要包括PPARα、PPARβ和PPARγ三種亞型，主要參與調節糖代謝平衡、脂質和脂蛋白代謝、細胞增殖與分化和凋亡。近年來該信號通路的表達及干預的意義已開始成為國內外研究的熱點，酰基輔酶A合成酶(ACS)主要分布于肝臟和腎臟，可促進肝臟攝取脂蛋白脂酶脂解生成的游離脂肪酸，并轉化為乙酰CoA，防止脂肪酸進入細胞后的流失。我們研究發現附子、干姜、花椒可以上調膽酰CoA合成酶，增加乙酰CoA的生成，進入三羧酸循環氧化供能，熱量生成增多。

花生四烯酸代謝[63](Arachidonic acid metabolism)途徑：包括環氧化酶(COX)、脂氧合酶(LOX)和細胞色素P450(CYP450)3種途徑，花生四烯酸系統對細胞和器官功能的影響主要依賴幾十種相關酶的共同作用，上百種代謝產物與相應的蛋白質(包括受體、信號分子等)結合和相互作用等共同介導。細胞功能狀態改變或受到外界刺激能導致花生四烯酸代謝通路的改變，同時也影響每個通路代謝產物之間的穩態，從而導致細胞乃至機體的功能紊亂。特別是花生四烯酸代謝一條通路改變或出現異常時，會直接或間接影響其他代謝途徑、甚至會影響生物體的整體代謝。細胞色素P450(cytochromeP450或CYP450)[64]是一種含亞鐵血紅素的單加氧酶，主要分布于肝臟，在小腸、肺、腎、腦中也依次有少量分布。哺乳動物組織中P450在藥物和異型生物的代謝。它參與內源性物質和外源性物質代謝。細胞色素P450作為一種末端加氧酶，主要分布在內質網和線粒體內膜上，參與生物體內類固醇激素合成、膽汁酸、膽固醇及多未飽和脂肪酸轉化為生物活性分子的過程中都起著重要作用[65]。由于細胞色素P450也對細胞因子和體溫調節都有重要影響，附子、干姜、花椒可以上調細胞色素P450 3A18，調控參與類固醇激素的合成，可促進激素轉化，減少其滅活和排泄，提示附子、干姜、花椒促進生物體內類固醇代謝，增強機體代謝過程。

3.3.2 附子、干姜、花椒提高對能量的利用 附子、干姜、花椒提高對能量的利用主要通過如下途徑。

氨基酸代謝途徑[58]：氨基酸是構成蛋白質分子的基本單位，也能作為嘧啶、嘌呤、卟啉等生物合成的前體。其主要功能是合成蛋白質，也合成多肽及其他含氮的生理活性物質，體內的各種含氮物質幾種都可由氨基酸轉變而成，包括蛋白質、膚類激素、氨基酸衍生物、黑色素、肌酸、胺類、輔酶或輔基等，并可以氧化分解代謝提供機體所需能量；氨基酸分解所生成的α-酮酸可以轉變成糖、脂類或再合成某些非必需氨基酸，也可以經過三羧酸循環氧化成二氧化碳和水，并放出能量。本次研究發現大鼠灌胃給予附子、干姜、花椒水煎液后，與氨基酸代謝相關的蛋白醛氧化酶X、D-氨基酸氧化酶上調，醛氧化酶(Aldehyde Oxidase，AOX)是一類高度保守的鉬-黃素蛋白，主要存在于哺乳動物細胞質中，具有廣泛的底物特異性，可催化醛類及含氮、含氧雜環類化合物的氧化反應。該酶體內分布較廣，存在種屬及個體間差異，在藥物及外源物的I相代謝中發揮重要作用。AOX依賴的代謝反應可能影響相關藥物的藥效、代謝特性與毒性反應。D-氨基酸氧化酶(D-amino Acid Oxidase：Oxidoreductase，DAAO)[59]是一種典型黃素蛋白酶，以黃素腺嘌呤為輔基。可氧化D-氨基酸的氨基生成相應的酮酸和氨，使生糖、生酮氨基酸分解加快，提高對能量的利用。

N-聚糖生物合成途徑：N-聚糖主要參與新生膚鏈的折疊、維持蛋白質正確構象的生理過程，極性細胞中蛋白質的分揀。N-聚糖生物合成需要消耗能量，本實驗上調N-聚糖生物合成途徑中的多萜基二磷酸寡聚糖蛋白糖基轉移酶1，提高對能量的利用。

核糖體(Ribosome)[54]，又稱核蛋白體，細胞中普遍存在核糖體除哺乳動物成熟的紅細胞。核糖體是細胞內一種核糖核蛋白顆粒(ribonucleoprotein particle)，主要由RNA(rRNA)和蛋白質構成，其惟一功能是按照mRNA的指令將氨基酸合成蛋白質多肽鏈，所以核糖體是細胞內蛋白質合成的分子機器。附子、干姜、花椒上調60S酸性核糖體磷蛋白P2，蛋白質合成旺盛，耗能增多。

脂肪酸生物合成途徑[60]：脂肪酸生物合成是機體代謝途徑之一，具有廣泛的應用前景，肝臟是脂肪酸生物合成的主要部位，同時也在腦、肺、腎等組織中合成。脂肪酸合成的起始原料是乙酰輔酶A，在細胞液中進行。機體內的脂肪酸大部分來源于食物，為外源性脂肪酸，在體內可通過改造加工被機體利用。同時機體還可以利用糖和蛋白轉變為脂肪酸稱為內源性脂肪酸，用于甘油三酯的生成，貯存能量。脂肪酸合酶[61](Fatty Acid Synthase，FASN)是多功能酶復合體，主要參與內源性長鏈脂肪酸的合成，是體內合成內源性飽和脂肪酸的關鍵酶，在體內各組織中廣泛存在，參與細胞增殖、分化和機體能量代謝、脂類代謝等重要生命活動。有研究表明[69]：抑制FASN，可使乙酰CoA更多進入三羧酸循環產生能量而被消耗，從而減少脂肪的合成和儲存。Kim等研究表明，FASN的抑制劑C75可以通過激活CPT-1酶使得小鼠周圍脂肪組織的β氧化活躍，增加機體的脂肪消耗。附子、干姜、花椒可以抑制脂肪酸合酶，提高對機體能量的利用。

胰島素信號通路[62]：肝臟在人體的葡萄糖代謝中有著重要作用，從胰島素與其受體(InsR)結合開始，肝臟糖代謝構成了一個復雜的傳導通路，起到穩定血糖的生理作用。肝臟胰島素抵抗主要表現為胰島素抑制內源性葡萄糖生成的能力減弱和肝糖原合成減少。肝臟是人體內葡萄糖攝取和利用的重要場所。葡萄糖進入肝細胞后，一部分進入三羧酸循環進行氧化磷酸化為細胞提供能量，另一部分在糖原合成酶的作用下合成肝糖元。糖原磷酸化酶[53](glycogen phosphoryl-ase)是催化糖原降解的關鍵酶，為機體組織提供葡萄糖，或是直接進入無氧代謝和有氧代謝途徑以參與能量供應。糖原合酶是糖原合成過程的限速酶，糖原合成是耗能過程。本次研究發現大鼠灌胃給予附子、干姜、花椒水煎液后，與胰島素信號通路相關的蛋白糖原合酶上調，糖原合成增多，耗能增多，但是同時能上調糖原磷酸化，加快肝糖原分解，供應機體所需能量。

機體內糖、脂肪和蛋白質的氧化分解提供人體一切生命活動所需要的全部能量，糖、脂肪和蛋白質這三類營養物質中包含能被機體利用的化學能，是人體活動的直接能源物質。能量代謝與物質代謝相互影響，物質在合成代謝時，需要獲取能量，而物質在氧化分解過程中，伴有能量的釋放。通常我們把伴隨物質代謝過程中發生的能量的貯存、釋放、轉移和利用稱為能量代謝。熱性中藥附子、干姜、花椒主要通過調控代謝相關蛋白的表達來影響機體代謝過程，增加體內熱量的產生和提高對熱量的利用兩方面影響機體的能量代謝。其中主要通過調控脂肪酸代謝、類固醇激素生物合成、谷胱甘肽代謝、細胞色素P450代謝、糖代謝、檸檬酸循環等十幾個代謝途徑增加機體熱量的生成，通過控制和調節氨基酸代謝、N-聚糖生物合成、核糖體、脂肪酸生物合成、胰島素信號通路5個代謝途徑提高機體對能量的利用。本文實驗結果進一步證明附子、干姜、花椒是通過不同途徑影響機體的能量代謝，促進機體能量代謝的中藥具有熱(或溫)性，與匡海學教授的中藥性味科學內涵新假說相一致。

圖2 熱性中藥的共有差異蛋白通路分析

4 討論

蛋白質組學是指在特定的時間和空間內一個基因組、一種組織或一種生物、細胞所表達的包括所有亞型以及經過修飾的全部蛋白質。蛋白質的表達、蛋白質的結構和蛋白質的功能分別稱為表達蛋白質組學、結構蛋白質組學和功能蛋白質組學，是蛋白質組學主要研究內容。現階段，蛋白質組學的研究受到國內外廣泛關注，因為人體的各種代謝和調控途徑主要由蛋白質執行，我們只有不斷進行篩選和鑒定樣本中的蛋白，才能進一步探明疾病的發生、監控疾病的進程和每個階段相應的蛋白表達水平的關聯性及規律性。為尋找藥物的作用靶點、作用模式、藥物的功效，毒理研究和篩選疾病的標志性蛋白奠定理論基礎。使我們對人類生命本質的認識和疾病的發生發展機制提升到一個更高的層次。

本實驗選擇iTRAQ技術，該技術是在2004年由美國應用生物系統公司推出的一項新的同位素標記技術。基本工作原理為：iTRAQ標記試劑能與賴氨酸側鏈或肽段的N端發生反應，完成對肽段的標記。標記完成后對本次實驗所有樣本進行混合，一次可同時處理的樣本數為8個。首先進行一級質譜，在選擇母離子時，不同標記的樣本同一個肽段表現為一個峰，和一級質譜強度相比較增強了8倍，有利于廣泛的鑒定。然后進行二級質譜，iTRAQ試劑發生斷裂，其中平衡基團發生中性丟失，該基團主要使iTRAQ試劑整體質量一樣。報告基團的強度直接反映肽段的相對豐度，其質量從113-121，但是不包括120，因為120和苯丙氨酸的亞胺離子相同。在蛋白質組學研究中，相對于傳統的定性及定量方法，該技術對蛋白的檢測范圍廣泛，pH值檢測線性范圍為0-13；對蛋白的分子量檢測范圍更廣泛，可以檢測蛋白的分子量為8-280KD的蛋白；iTRAQ技術可以檢測出更多的低豐度(蛋白含量)蛋白，甚至對其他技術不能檢測到的跨膜蛋白也可以靈敏的檢測到。因具有高靈敏度、標記效率高、高分辨率、樣品兼容性好、重復性好等優點，使該技術在蛋白質組學的研究和應用中被廣泛應用。

匡海學教授提出的中藥性(氣)味科學內涵的新假說，其核心內容之一是“中藥的藥性(氣)是藥物通過不同途徑以主要影響機體的能量代謝、物質代謝為特征的，可影響藥物療效發揮或與副作用發生有關的一類生物學效應。促進機體能量代謝、物質代謝的中藥具有熱(或溫)性，抑制機體能量代謝、物質代謝的中藥具有寒(或涼)性。”據此可以認為，能夠系統反映機體代謝狀況的代謝組學技術與方法以及能夠系統反映調控機體代謝狀況的蛋白質組學技術與方法，是非常適于中藥藥性研究的技術與方法。

本文依據匡海學教授的中藥性味科學內涵新假說，基于蛋白質組學技術的研究方法，通過對代表性的溫熱中藥附子、干姜和花椒開展大鼠能量代謝和生物標志物相結合的研究，探討溫熱中藥在影響機體物質代謝和能量代謝以及三者在藥味和功效中存在的共性。

眾所周知，附子、干姜、花椒均為溫熱中藥，并具有相似的藥味和功效，現代研究也證明三者在藥理作用上存在共性，為加強治療效果，有時臨床還配伍使用。

本文研究結果表明：附子、干姜、花椒篩選出共同差異蛋白(誘導或抑制相關蛋白)，在抗腫瘤、抗衰老、保肝、鎮痛、抗炎、對心血管的作用中能對抗相關疾病的發生、發展，這可能是三者具有相似藥味和功效的真正內涵，也為揭示中醫臨床“同病異治”，臨床應用中藥配伍的復方提供理論依據。

研究結果還證明，溫熱中藥附子、干姜和花椒的確都能通過多途徑增強機體的物質代謝和能量代謝。同時，篩選出溫熱中藥附子、干姜和花椒與機體物質代謝和能量代謝相關的50個差異蛋白。在此基礎上，通過DAVID蛋白通路分析，篩選出與能量代謝相關通路18個。通過本文蛋白質組學的研究闡明，熱性中藥附子、干姜、花椒影響機體物質代謝和能量代謝主要通過兩條途徑來實現的。一是主要通過調控代謝相關蛋白的表達，如通過上調糖原磷酸化酶、UDP-葡萄糖6-脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸羥激酶等相關蛋白的表達，調節丙酮酸代謝途徑、三羧酸循環、脂肪酸代謝、糖代謝(淀粉-蔗糖代謝、核糖體、糖酵解/糖異生)等途徑的相關蛋白質來影響機體代謝過程，加快肝糖原分解，減少糖原合成，增加體內熱量的產生；并通過上調O-肉堿棕櫚酰轉移酶2、醛脫氫酶X蛋白的表達，促進脂肪酸代謝，增加體內熱量的產生；通過過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)途徑上調膽酰CoA合成酶，增加乙酰CoA的生成，進入三羧酸循環氧化供能，熱量生成增多；通過花生四烯酸代謝(Arachidonic Acid Metabolism)途徑，上調細胞色素p450 3A18，調控參與類固醇激素的合成，可促進激素轉化，減少其滅活和排泄，增強機體代謝過程。二是熱性中藥附子、干姜、花椒通過調控氨基酸代謝相關蛋白的表達，如通過氨基酸代謝途徑，上調蛋白醛氧化酶X、D-氨基酸氧化酶，增強體內氨基酸代謝、生酮或生糖氨基酸的分解代謝，產生三羧酸循環的中間產物或轉變為糖或繼續氧化提供能量；通過上調類固醇17-α-羥化酶的表達，調控參與類固醇激素的合成，促進生物體內類固醇代謝，并能通過N-聚糖生物合成途徑，上調N-聚糖生物合成途徑中的多萜基二磷酸寡聚糖蛋白糖基轉移酶1，提高對能量的利用；通過脂肪酸生物合成途徑，下調脂肪酸合酶的表達，提高對機體能量的利用；通過胰島素信號通路上調相關的蛋白糖原合酶，使糖原合成增多，耗能增多。

這些研究結果，與此前匡海學等[38]采用UPLC-QTOF-MS法確定18個與能量代謝相關的內源性生物標志物，而這些代謝物主要參與氨基酸代謝、糖代謝、花生四烯酸代謝、磷酸戊糖途徑來影響機體的能量代謝結果相一致。這也進一步驗證了匡海學教授提出的中藥性味科學內涵新假說的客觀性。

綜上所述，中藥藥性具有整體性、動態性、時空性、復雜性等特點，這與蛋白質組和代謝組學的很多特征相似，所以以蛋白質組學為切入點進行中藥藥性實質研究具有很大的優勢，目前的研究成果也表明，這一研究思路是可行的，突破了中藥藥性理論研究的局限性，成為理論研究與實驗研究的橋梁。因此將蛋白質組和代謝組結合為切入點，深入進行中藥藥性實質的研究，不僅有利于從微觀的角度了解中藥藥性的物質基礎，而且將為中藥藥效的研究提供理論依據，也將為中藥藥性研究提供新的思路和方法，這些對促進中醫藥現代化將具有重要作用。組學概念的提出為作者提供一個整體研究中藥藥性的新思路。通過高通量、大規模的整體研究模式，從系統生物學(蛋白質組學、代謝組學、基因組學、轉錄組學)系統地研究中藥藥性理論，可以全面了解相關基因、蛋白質或代謝物在機體發生、發展過程中的變化規律。目前，對于中藥藥性的研究，蛋白質組學和代謝組學研究的相比較多。建立和完善蛋白質組學和代謝組學技術平臺，可從兩個水平(蛋白組學、代謝組學)檢測目的樣品的差異性，篩選出組織、細胞、機體的病理生理或代謝水平的潛在變化。代謝組(metabolomics)學來源于代謝譜分析。代謝組學不僅能全面定量的闡釋內源性代謝物，還對內因和外因變化規律有一定的影響，代謝組學方面是篩選代謝循環中相對分子質量小于1000的小分子內源性代謝物的變化，檢測的內源性代謝物直接參與機體的各種代謝、循環，其水平高低在一定程度上反映了機體生化代謝的功能和狀態或細胞、組織的代謝應答變化。蛋白質組學主要采用雙向凝膠電泳(2DE)、雙向熒光差異凝膠電泳(DIGE)、質譜(MS)及蛋白芯片等方法對蛋白的表達、分布、相互作用等進行全面的、整體的研究，即研究組織或細胞中全部蛋白質的科學。主要采用分子生物學先進的篩選技術，對組織或細胞中蛋白質的整體進行歸類、鑒定并分析感興趣的差異表達的蛋白質，最終明確它們的功能、相互作用。中藥藥性在蛋白質組學和代謝組學方面的任務不僅是鑒定出差異蛋白質和差異代謝產物，關于蛋白質組學，要進一步明確蛋白質功能和全面了解蛋白質及它們的修飾和相互作用網絡分析，關于代謝組學，是要去分析影響中藥藥性的代謝途徑，并將代謝組學和蛋白質組學關聯起來，整合成垂直型分析，這樣能夠較完整地揭示藥物如何通過多種途徑作用于生物體多個靶點發揮整合調節的優越性及其機理，同時對療效評估也具有重要意義。這種“整合”的研究方式也正是系統生物學的重點。希望在代謝組學的協助下，中藥藥性在蛋白質組學上能夠將基礎研究成果快速轉化成實用方法，應用到更多領域中。

本文借助蛋白組學研究思路與技術，針對復雜生物樣本的特殊性，開發了全新的目標蛋白富集、目標蛋白定性定量—iTRAQ技術。建立的這種基于iTRAQ技術結合2D-LC-MS/MS評價溫熱中藥(附子、干姜、花椒)對機體肝臟組織的能量代謝及物質代謝相關蛋白定量的方法，也可作為評價中藥寒熱藥性的普適性方法。

實際上，寒熱藥性是從藥物對機體陰陽盛衰、寒熱變化的影響這一特定角度概括藥物的作用的，并不能包括藥物的所有功效。本次獲得的蛋白質組學的數據與信息，不僅包含了藥物寒熱藥性的信息，肯定也包含著藥物藥味(功效或藥效)的信息，亦或有些信息既是藥物寒熱藥性的信息，同時也是藥物藥味(功效或藥效)的信息。這也證實了匡海學教授的中藥性味科學內涵新假說中關于“中藥同時具有性(氣)與味，性(氣)與味是中藥(包括方劑、單味中藥、有效部位或組分、單體化合物)同時兼具的兩種特性。藥味與藥物的具體功效相關。”的正確性。另一方面，在這些信息中，不僅能夠找出溫熱中藥的共有生物標志物信息，如同本文所述的那樣，也能找到或發現不同溫熱中藥的特有的生物標志物的信息。因此，對獲得的這些蛋白質組學信息的深入發掘，進一步對中藥的四性與五味，甚至與歸經等開展綜合研究，全面認識和掌握中藥的性能將成為我們后續的一項重要研究工作。

[1]Cai Z,Chiu JF,He QY.Application of proteomics in the study oftumor metastasis[J].Geno Prot Bioinfo，2004，2(3):154-166.

[2]Wilkins MR,Pasquali C,Appel RD,et al.From proteins to proteomes:large scalc protein identif-ication by two-dimensional electrophoresis and amino acid analysis [J].Biotechnology，1996，14(1):61-64.

[3]Wasinger VC，Cordwell SJ，Cerpa-Poljak A，et al.Progress with gene-product mapping of the Mollicutes:Mycoplasma genitalium[J].Electrophoresis，1995,16(7):1090-1093.

[4]Anderson NL,Matheson AD,Steiner S.Proteomics:applications in basic and applied biology [J].Curr Opin Biotechnol,2000，11(4):408-412.

[5]隋峰,楊娜,張暢斌,等.寒熱性中藥成分對TRPV1和TRPM8通道蛋白基因表達的影響[J].中國中藥雜志,2010,35(12):1594-1597.

[6]崔光志,李峰,宋曉玲,等.胡椒、蓽茇對正常大鼠肝臟能量代謝因子的影響[J].世界科學技術-中醫藥現代化,2013,15(6):1314-1316.

[7]李毅,楊貞,許健.溫熱中藥對寒癥模型大鼠肝線粒體蛋白質組的影響[J].中草藥，2014,45(3):373-378.

[8]彭淑紅,黃麗萍,高小恒,等.寒性中藥對大鼠骨骼肌能量代謝相關因子的影響[J].中國中藥雜志,2009,34(23):3064-3066.

[9]李健,李峰,王厚偉,等.中藥藥性與蛋白質含量相關性研究[J].山東中醫藥大學學報，2009，33(3):181-183.

[10]黃麗萍,彭淑紅,蒙曉芳,等.熱證大鼠脂肪代謝及解耦聯蛋白1 mRNA表達的相關研究[J].遼寧中醫雜志,2010,37(3):541-543.

[11]Aranda B，Achuthan P，Alam-Faruque Y，et al.The IntAct molecular interaction database in 2010[C]，Nucleic Acids Res,2010,38：D525-531.

[12]Ceol A，Chatr Aryamontri A，Licata L，et al.MINT，the molecular interaction database：2009 update[J].Nucleic Acids Res,2010，38：D532-539.

[13]姜萍,李曉,李壽松.從中藥四氣五味歸經功效分析丁書文教授治療高血壓病用藥特色[J].中華中醫藥雜志,2013,7(28):1951-1953.

[14]盧訓叢.中藥性味歸經理論的研究思路與方法[J].中國中醫基礎醫學雜志，2006，12(11):803-804.

[15]閻愛榮,張宏.附子的藥理研究[J].中國藥物與臨床,2008,9(8):745-747.

[16]龍全江,徐雪琴.干姜化學成分、藥理作用及加工炮制研究文獻分析[J].現代中藥研究與實踐,2015,29(1):82-83.

[17]朱雪,王亮.花椒藥理作用研究進展[J].社區醫學雜志,2010,8(7):43-45.

[18]鄭美蓮,黃家深.硒谷胱甘肽過氧化物酶與腫瘤[J].癌癥,1989,8(5):399-401.

[19]姜亮,韓金祥,常曉天.碳酸酐酶與腫瘤相關性研究進展[J].中華腫瘤防治雜志,2012,19(18):1433-1436.

[20]朱玉丹,王蕾,方利洲,等.胸部腫瘤患者肋間肌碳酸酐酶Ⅲ及其mRNA表達的研究[J].中國癌癥雜志,2014,12(24):895-900.

[21]湯菲,安黎云,賈克然.腦型糖原磷酸化酶在人結、直腸腫瘤中的表達[J].國際檢驗醫學雜志,2014,35(23):3187-3189.

[22]董蘭鳳,劉京生,苗智慧,等.附子多糖對H22和S180荷瘤小鼠的抗腫瘤作用研究[J].中國中醫基礎醫學雜志,2003,9(9):14-17.

[23]蒲華清,王秉翔,杜愛玲,等.6-姜酚在不同環境中對人肝癌細胞株殺傷和化療增敏作用的研究[J].中華老年醫學雜志,2014,33(4):424-428.

[24]袁太寧,肖長義,汪鋆植.花椒抗宮頸癌Caski細胞作用及其機制的初步研究[J].時珍國醫國藥,2009,20(5):1119-1120.

[25]王兆君,李田昌,楊曄,等.非諾貝特對衰老大鼠肝臟組織酰基輔酶A合成酶的影響[J].醫藥導報,2012,31(6):698-700.

[26]田秋芬,龔傳美.附子瀉心湯煎劑抗衰老藥理作用的實驗觀察[J].解放軍醫學高等專科學校學報,1996,24(3):58-59.

[27]李愛華.生姜抗氧化作用的研究[J].食品科學，1995,16(12):35-38.

[28]凌智群,萬杰,胡苗苗,等.花椒多酚類化合物抗自由基抗氧化損傷的研究[J].時珍國醫國藥,2009,20(8):1941-1943.

[29]甄為.羧酸酯酶1對大鼠頸動脈損傷后血管狹窄及炎性反應的影響[D].沈陽:遼寧醫學院,2014.

[30]高博聞,孫凡,朱亮.兒茶酚-O-甲基轉移酶抑制劑臨床應用進展[J].現代生物醫學進展,2014,14(5):982-985.

[31]張野,江三多,錢伊萍，等.情感性精神障礙與兒茶酚鄰位甲基轉移酶基因的關聯性研究[J].中華精神科雜志，2002,35(4):206-208.

[32]徐紅萌,姜慧卿.附子對神經病理性疼痛大鼠的鎮痛作用[J].中華麻醉學雜志,2005,25(5):381-384.

[33]王夢,錢紅美,蘇簡單.干姜乙醇提取物解熱鎮痛及體外抑菌作用研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2003,14(5):299.

[34]王朝暉.花椒揮發油鎮痛作用的實驗研究[J].中國藥房,2011,22(3):218-219.

[35]楊景鋒,趙天才.芍甘附子湯對AA大鼠免疫調節及關節滑膜超微結構形態的影響[J].陜西中醫學院學報,2004,27(3):65-67.

[36]蔣蘇貞,廖康.干姜醇提取物對實驗性胃潰瘍的影響[J].中國民族民間醫藥,2010,19(8):79-80.

[37]袁娟麗.花椒揮發油的抗炎、鎮痛作用[J].中藥材,2010,33(5):794-797.

[38]秦冉冉,王志浩.蛋白質二硫鍵異構酶參與血栓形成的研究進展[J].心血管病學進展,2015,36(4):519-523.

[39]崇愛國,劉伏元,許明生,等.兔動脈粥樣硬化形成過程中血管平滑肌細胞層肉堿棕櫚酰轉移酶ⅠmRNA表達下調[J].中國動脈硬化雜,2007,15(8):618-621.

[40]高博聞,孫凡,朱亮.兒茶酚-O-甲基轉移酶抑制劑臨床應用進展[J].現代生物醫學進展,2014,14(5):982-984.

[41]秦永剛,張美榮,張建平,等.不同蒸煮時間對附子強心作用及心臟毒性的影響[J].醫學信息,2002,15(10):618-619.

[42]周靜,楊衛平,李應龍,等.干姜水煎液對急性心肌缺血大鼠血漿血管緊張素Ⅱ、血清腫瘤壞死因子α、丙二醛、一氧化氮的影響[J].時珍國醫國藥,2014,25(2):288-290.

[43]許青媛,楊甫昭.花椒粗提物對應激性心肌損傷的保護作用[J].中草藥,1993,24(5):277-277.

[44]許沙沙,郭連峰,吳妍,等.235例孕婦乙肝病毒標志物檢測結果及丙氨酸轉氨酶變化分析[J].中國衛生檢驗雜志,2015(25):2355-2359.

[45]蔡曉波,陸倫根.谷胱甘肽過氧化物酶與肝臟疾病[J].世界華人消化雜志,2009,17(32)：3279-3282.

[46]郭尹玲,扈曉宇,鐘森,白松林.附子對免疫性肝損傷模型大鼠的影響及代謝組學研究[J].西部醫學,2010,22(5):797-799.

[47]張明發,蘇曉玲,沈雅琴.干姜現代藥理研究概述[J].中國中醫藥科技，1996,3(2):46-48.

[48]張明發,沈雅琴,朱自平,等.花椒“溫中止痛”藥理研究[J].中國中藥雜志,1991,16(8):493-497.

[49]Kuang HX，Wang YY，Wang QH，et al.Metabonomics research of the four properties in traditional Chinese medicine based on UPLC-QTOF-MS system[M].Edited by Haixue Kuang，Theories and Practice of Chinese Medicine,Intech，2011:13-28.

[50]吳東輝,楊權,許崇濤.應激對大鼠海馬谷氨酸、天冬氨酸和γ-氨基丁酸含量的影響[J].中華精神科雜志,2003,36(2):98-100.

[51]傅雯萍,王維亞,王恒.葡萄糖醛酸轉移酶1A1G71R突變和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷對新生兒膽紅素濃度的影響[J].中國實用兒科雜志,2006,21(6):453-454.

[52]朱惠蓮.丙酮酸對肥胖大鼠體重和脂肪代謝的影響[J].營養學報,2002,24(3):229-232.

[53]湯旭蓁,關騰,錢貽崧,等.糖原磷酸化酶抑制劑山楂酸對小鼠血糖和肝糖原的影響[J].中國天然藥物,2008,6(1):53-56.

[54]王輝,劉偉利.核糖體蛋白基因表達與腫瘤的關系[J].生理科學進展,2007,38(4):376-379.

[55]彭秋平.糖酵解代謝在惡性腫瘤細胞中的特異性表型及其意義[J].臨床腫瘤學,2009,5(14):470-473.

[56]譚斌斌.2型糖尿病患者血漿中脂肪酸代謝譜的研究[D].長沙:中南大學,2010.

[57]王草葉,王玉邦.類固醇激素合成急性調節蛋白研究進展[J].中華男科學雜志,2006,12(08):733-736.

[58]吳宏偉,高健,李韶菁,等.基于液相色譜-串聯質譜的氨基酸代謝組學方法研究黃芪注射液治療腦缺血[J].分析化學(FENXI HUAXUE)研究報告,2013,3(41):344-348.

[59]趙文娟,殷明.中樞神經系統D-氨基酸氧化酶的研究進展[J].生理科學進展,2008,39(1):64-65.

[60]武臨專.脂肪酸生物合成—發現抗菌藥物的靶位[J].國外醫藥抗生素分冊,2003,24(9):208-212.

[61]杜建青,趙婷婷,許丹焰.脂肪酸合酶與冠心病的關系[J].中國動脈硬化雜志,2011,19(3),277-231.

[62]李義.由胰島素信號通路篩選糖尿病藥物作用靶點[J].基礎醫學與臨床,2004,24(6):602-605.

[63]夏炎枝,王西明,段秋紅,等.軟脂酸誘導HepG2細胞胰島素抵抗及花生四烯酸防治作用的機制研究[J].中國老年學,2005,2(1):25-27.

[64]程婕,楊凌.細胞色素P450氧化還原酶的研究進展[J].中國藥理學通報,2006,22(2):129-133.

[65]郭淑華.促性腺激素(FSH)對甾類激素合成調節作用的研究[J].濰坊學院學報,2015,11(5):72-74.

[66]陳蔚,陳雯潔,夏燕萍,等.黃芪多糖對糖尿病倉鼠脂代謝紊亂及心肌PPAR-α表達的影響[J].復旦學報,2010,37(2):194-215.

[67]廖晨鐘,鄧沱,山松,等.以PPAR-γ為靶標的抗2型糖尿病藥物研發策略[J].中國新藥雜志,2003,12(12):980-983.

[68]王芳,馬向華,沈捷,等.PPAR-γ激動劑對瘦素刺激的血管平滑肌細胞增殖的影響[J].南京醫科大學學報:自然科學版,2008,28(3):300-303.

[69]杜建青,趙婷婷.脂肪酸合酶與冠心病的關系[J].中國動脈硬化雜志,2011,19(3):227-231.

(2015-12-09收稿 責任編輯：洪志強)

Based on proteomics to study the property and flavor of Radix Aconiti Lateralis Preparata，Rhizoma Zingiberis，Pricklyash Peel

Wang Qiuhong，Yang Xin，Li Xuelei，Yang Bingyou，Wang Yanhong，Kuang Haixue

(HeilongjianguniversityofChinesemedicine，KeyLaboratoryofChineseMedica，MinistryofEducation，HeilongjiangKeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicinePharmacodynamicMaterial，Harbin150040,China)

Objective:Study on warm-heat natural herbs(adix Aconiti Lateralis Preparata，Rhizoma Zingiberis，Pricklyash Peel)energy metabolism and expression of liver protein in normal rats，and made warm-hot drug in property and flavor-effect-pharmacological effects difference sand similarities，to provide theoretical basis for the property and flavor of medicines scientific connotation of warm-heat natural herbs.Methods:Adopt Sprague Dawley rats，each group after continuous administration of 21 d，the rats were anesthetized via an intraperitoneal injection of 1% pentobarbital sodium(0.15 mL per 100 g body weight).Liver proteins are separated by differential centrifugation，BCA protein quantitation by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)，using iTRAQ technology combined with the 2D-LC-MS/MS analysis method identification of liver proteins.Results:Compared with the control group，warm-heat natural herbs have identified significantly altered 50 differential proteins，with 39 proteins significantly increased and 11 decreased in response.50 different proteins mainly distributed in 18 pathways，many pathways related to energy metabolism.Conclusion:Radix Aconiti Lateralis Preparata，Rhizoma Zingiberis and Pricklyash Peel such as warm-heat natural herbs have differences and similarities in proteomics.This commonality is reflected not only in the substance and energy metabolism，but also reflected in the pharmacological effects.Two aspects affect the body's energy metabolism：increasing heat generation and increase the energy utilization.The results of the study for “Chinese medicine has the property(gas)and flavor，the characteristics of characteristics of property(gas)and flavor.Flavor of a drug was related with specific efficacy.Property of a drug affects the body's energy metabolism and substance metabolism by different pass ways.Influencing therapeutic effects of drugs or lead to side-effect associated with biological effects.” Nature and flavor of medicines theory provides a scientific basis.At the same time as the evaluation of traditional Chinese medicine provides a new method for Cold and Hot natural properties.

Radix Aconiti Lateralis Preparata; Rhizoma Zingiberis; Pricklyash Peel; Nature and flavor of medicines; Cold and Hot natural properties; Energy metabolism; Pharmacological effect; Proteomics

國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)資助項目(編號:2013CB531801)；黑龍江中醫藥大學研究生創新科研項目(編號:2015009)

王秋紅(1969—)，女，教授，博士研究生導師，主要從事中藥炮制學及中藥藥性理論研究；Tel：(0451)87266856,E-mail：qhwang668@sina.com

匡海學(1955—)，男，教授，博士研究生導師，主要從事中藥藥性理論及中藥及復方藥效物質基礎研究；Tel:：(0451)82193001,E-mail：hxkuang56@163.com

R28

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.12.003