黃花敗醬發狀根培養體系的建立及其抑菌作用研究

趙 雪 孔維軍 麻馨月 常桂英 董長穎 楊世海

(1 吉林農業科技學院,吉林,132101; 2 中國醫學科學院藥用植物研究所,北京,100193; 3 吉林農業大學,長春,130118)

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黃花敗醬發狀根培養體系的建立及其抑菌作用研究

趙 雪1,2,3孔維軍1麻馨月1常桂英1董長穎1楊世海2

(1 吉林農業科技學院,吉林,132101; 2 中國醫學科學院藥用植物研究所,北京,100193; 3 吉林農業大學,長春,130118)

目的:初步建立黃花敗醬發狀根培養體系,并考察其抑菌效果。方法:采用發根農桿菌1601、15834、A4、1000等4種G-土壤桿菌誘導黃花敗醬外植體產生發狀根,考察不同外植體、菌株、侵染時間、預培養和共培養時間對黃花敗醬毛狀根誘導率的影響,并對發狀根進行PCR檢測;同時采用紙片擴散法測定其抑菌效果。結果:黃花敗醬莖段作為外植體,預培養和共培養48 h,發根農桿菌A4侵染8 min,MS液體培養基pH為6時添加蔗糖濃度為40 g/L時轉化率和增殖量最高,提取毛狀根中總黃酮的含量為9.12%。應用PCR證實A4質粒上的rolB基因片段成功轉入被感染的黃花敗醬發狀根中。結論:建立了黃花敗醬毛狀根培養體系,其發狀根提取液對金黃色葡萄球菌具有較好的抑制作用。

黃花敗醬;發根農桿菌;發狀根;抑菌作用

黃花敗醬(PatriniascabioscaefoliaFisch)別名黃花龍芽、野共花、鶴立雞群,為敗醬科(Valerianaceae)敗醬屬(Patrinia)植物,根或全草入藥,是我國傳統常用中藥之一,主產于黑龍江、河北、湖南等省[1-2]。黃花敗醬草的全面研究始于20世紀60、70年代,其草內含有皂苷類、黃酮類、揮發油類等多種藥用成分,其中以三萜皂苷和黃酮類為主要活性成分[3],具有清熱解毒、利濕排膿,祛瘀止痛的功效[4]。臨床研究表明在治療流行性鼻腔炎、腮腺炎、慢性盆腔炎及闌尾膿腫癥狀等方面有很好的療效[5]。除此之外,該草藥還有解毒排膿、治療子宮炎及產后脫宮蓄膿的功效。黃花敗醬種子中的Sulfapatrinosides有效成分可用于控制艾滋病(HIV),黃花敗醬提取液在延長戊巴比妥鈉對小鼠的睡眠時間上也有很明顯的作用[6]。隨著研究的不斷深入,黃花敗醬草的藥用價值逐漸提高,臨床應用和市場需求逐漸加大。利用發根農桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)侵染植物誘導毛狀根培養技術是繼離體培養技術之后的新型懸浮培養技術,可用于建立產生次生代謝產物的培養系統,具有遺傳穩定性、生長迅速、合成次生代謝物能力強、易于操作控制等優點,較傳統的細胞培養技術具有更廣闊的應用前景[7-9]。本研究利用4種發根農桿菌1601、15834、A4、1000誘導黃花敗醬組織產生毛狀根,初步建立黃花敗醬草發狀根離體擴增生長的培養體系,為下一步擴大培養黃花敗醬發狀根的研究提供可行性數據支撐,同時也為黃花敗醬發狀根培養體系的抑菌作用研究提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 無菌苗培養 黃花敗醬(PatriniascabioscaefoliaFisch)種子由吉林農業大學藥植園提供，經吉林農業大學中藥材學院楊世海教授鑒定。利用當年成熟干燥的黃花敗醬種子,加溫水浸泡12 h,在超凈操作臺內用無菌水清洗4次,75%乙醇浸泡30～40 s,無菌水清洗3次;后用4%次氯酸浸泡8～9 min,無菌水清洗5～6次。處理完后用滅菌濾紙將種子表面的水分吸干,用鑷子輕輕放置在MS固體培養基(100 mL錐形瓶)中,置于光照強度2 000 lx(光照12 h/d黑暗12 h/d交替培養)、設置溫度24～25 ℃進行培養,等待萌發無菌幼苗即為侵染用的外植體。

1.2 發根農桿菌的活化 發根農桿菌Agrobacteriumrhizogenes1601、15834、1000和A4菌株由中國農業微生物研究所菌種保藏中心提供,并于-70 ℃冰箱內保存備用。實驗時,在超凈操作臺內分別挑出A4、15834、1601和1000菌株,接種于固體YEB平皿上劃線,封口膜密封后置于28 ℃恒溫暗培養,1～2 d待長出單克隆菌斑后挑取單菌落,接種于加有30 mL卡那霉素(Kan+50 mg/mL)液體的YEB培養基中，28 ℃、180 r/min震蕩培養24 h后觀察YEB由透明的紅棕色漸漸變淡且呈現出云霧狀渾濁即可。取1 mL復蘇成功的菌液加入裝有50 mL YEB液體培養基中,于相同的條件下再次培養12 h,取對數生長期時的菌液對黃花敗醬外植體進行侵染。

1.3 黃花敗醬發狀根的誘導 在超凈操作臺內,將黃花敗醬無菌苗的葉片剪成0.3 cm×0.3 cm片段,莖段長度約0.3 cm左右。葉片和莖段分別置于MS固體平皿上,不添加外源激素置于24 ℃、黑暗條件下預培養48 h。在超凈操作臺中,將預培養的外植體(莖段、葉片)轉移至錐形瓶中,加入活化后的菌液進行侵染,輕搖錐形瓶,待外植體與菌液充分接觸侵染8 min后,取出外植體,用滅菌濾紙吸干表面菌液,接種到MS固體培養基上,24 ℃、黑暗條件下共培養48 h,然后轉接到含頭孢噻肟鈉(50 mg/L)的MS固體培養基中繼續暗培養,同時設立未被菌液感染的外植體作對照。每5 d轉板1次,直至完全除去農桿菌。25 d后觀察,統計誘導出的毛狀根數,計算黃花敗醬發狀根誘導率。最后,將生長迅速、根系發達、分支較多、除菌完全的黃花敗醬發狀根轉移到MS液體培養基中進行懸浮培養,建立黃花敗醬毛狀根離體培養體系。

發狀根誘導率(%)=(長出發狀根的外植體數/接種外植體的總塊數)×100%

1.4 發狀根的PCR檢測 根據已誘導出發狀根的形態及其生長無向地性等特點,可初步判定發狀根。為確定發根農桿菌中T-DNA片段是否整合進入黃花敗醬的核基因組中,對誘導出的毛狀根進行PCR分子鑒定[10]。在PCR擴增試驗中,陽性對照為菌株A4的質粒DNA擴增產物,陰性對照為未轉化植株DNA擴增產物,設計并合成擴增rolB的PCR引物,正向引物:5'-CTCCTGACAT-CAAACTCGTC-3',反向引物:5'-TGCTTCGAGTTAT-GGGTA-3'。正向引物反應條件95 ℃預變性1 min,94 ℃變性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,35個循環后,72 ℃總延伸7 min,于4 ℃保存。

1.5 毛狀根增殖液體培養基的篩選 在無菌條件下取0.8 g分枝多且長、除菌完全的黃花敗醬毛狀根分別放入到MS、1/2MS、R2和B5 4種不添加激素的液體培養基進行懸浮震蕩培養,26 ℃,轉速為160 r/min的條件下進行暗培養,每5 d測1次鮮重,25 d后觀察統計這4種培養基對黃花敗醬毛狀根增殖倍數的影響。

1.6 不同濃度的蔗糖對毛狀根增殖的影響 無菌條件下,取0.8 g分枝多且長、除菌完全的黃花敗醬毛狀根,分別放入含有濃度為5、10、20、30、40和50 g/L的蔗糖MS液體培養基中,25 d后稱取發狀根鮮重,考察培養基中加入的不同濃度蔗糖對發狀根增殖的影響。

1.7 不同pH值對毛狀根增殖的影響 取0.8 g分枝多且長、除菌完全的黃花敗醬毛狀根分別接種于pH為2,4,6,7,8,9的MS液體培養基中進行懸浮震蕩培養,搖床轉速為160 r/min,26 ℃恒溫培養,25 d后觀察統計這4種培養基對黃花敗醬毛狀根增殖倍數的影響。

1.8 總黃酮的含量測定

1.8.1 黃花敗醬發狀根提取液的制備 精密稱取烘干后的黃花敗醬發狀根和自然根各3 g,磨成粉末后用濾紙包好,放入加有石油醚(60～90 ℃)的索氏提取器中回流10 h脫脂。將脫脂后的粉末放置冷卻,待石油醚揮干后加入50 mL 70%乙醇,超聲提取3次,每次30 min,過濾后合并濾液,濃縮至干后稱重,以70%乙醇定容至100 mL,即得黃花敗醬發狀根提取液,備用[11]。

1.8.2 蘆丁標準品溶液的制備 精密吸取蘆丁標準對照品5 mg,70%乙醇溶液精確定容置至50 mL。精密吸取蘆丁標準品溶液0 mL,0.5 mL,1 mL,2 mL,3 mL,4 mL,分別置于10 mL的容量瓶中，加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，靜置5 min，然后加入10% Al (NO3)3溶液0.3 mL搖勻，靜置5 min后加入4%NaOH溶液4 mL,純凈水稀釋至刻度,搖勻靜置15 min，乙醇溶劑做為空白試劑在510 nm波長處測吸光度，繪制標準曲線。

取一定體積樣品以同一方法測吸光度，得回歸方程計算黃酮含量。

結果如圖1所示,計算得標準回歸方程y=0.065 6x+0.000 6,相關系數r為0.999 6。

圖1 測定黃酮含量的標準曲線

1.9 黃花敗醬發狀根提取液的抑菌作用研究

1.9.1 細菌菌株培養及陽性藥的制備 實驗菌種:金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門氏菌(Salmonellaenterica)和大腸桿菌(Escherichiacoli)由吉林大學畜牧獸醫學院惠贈。細菌培養:無菌條件下,將3種供試菌株分別接種于PDA培養皿中,密封后,28 ℃恒溫培養箱中培養48～96 h。在超凈操作臺內精確吸取硫酸慶大霉素注射液1.0 mL加入磷酸鹽緩沖液中,調pH 7.8，200 mL容量瓶中溶解并定容。密封冷藏保存。氯霉素(1.0 mg/mL):在超凈操作臺內,精確吸取氯霉素注射液0.8 mL置于pH 6.0的磷酸鹽緩沖溶液中,定容到100 mL無菌容量瓶中。密封,冷藏保存。頭孢曲松鈉(1.0 mg/mL):在超凈操作臺內,精確稱取1.0 g注射用頭孢曲松鈉干粉,以100 mL pH 6.0的磷酸鹽緩沖液溶解,密封,冷藏保存。

1.9.2 抑菌試驗 采用紙片擴散法[12]考察黃花敗醬發狀根提取液額抑菌作用。無菌條件下,將直徑5.0 mm的無菌濾紙片浸泡于供試溶液中2 h,將濾紙片均勻擺放于細菌培養基上,每個培養皿中3片,分別加入頭孢曲松鈉(陽性對照)、供試液和陰性對照液,重復3次。37 ℃培養箱中培養15～17 h后,采用十字交叉法測定抑菌圈的直徑,按如下公式計算抑菌率。

2 結果與分析

2.1 種子滅菌方法 將采用4%次氯酸和0.1%升汞滅菌后的黃花敗醬種子接種到MS固體培養基,25 d后考察不同處理方法對黃花敗醬種子出苗率的影響。結果見表1。

表1 不同處理方法對種子污染率的影響

從上表可以看出,2種消毒劑對黃花敗醬出苗率的影響不同,其中4%次氯酸效果優于0.1%升汞,且在8 min時消毒效果最佳。

2.2 不同菌株和外植體對發狀根誘導率的影響 侵染的外植體不同,發狀根的誘導率也會存在差異。采用發根農桿菌1000、A4、15834、1601等4種G-土壤桿菌浸染黃花敗醬葉片和莖段,25 d后觀察4種菌株的誘導效果,從表2和圖2可以看出,不同農桿菌和外植體對黃花敗醬發狀根的誘導有不同的影響,且顯著性差異(P<0.05)和極顯著差異(P<0.01)。A4菌株感染的外植體于18 d左右即能侵染出發狀根,而其余三種菌株較A4菌株誘導出的發狀根數目少很多;A4菌株對莖段的平均誘導率達到79.17%,而1000、15834和1601菌株的平均誘導率分別為30.56%、11.11%和22.22%。A4、1000、15834和1601菌株對葉片的平均誘導率分別為34.70%、18.05%、5.56%和15.28%。由此可見,發根農桿菌A4是誘導黃花敗醬莖段的最佳菌種。

圖2 黃花敗醬發狀根的誘導

注：a.A4侵染葉片;b.A4侵染莖段;c.莖段褐化

2.3 侵染時間不同對黃花敗醬發狀根誘導率的影響 農桿菌菌株對外植體侵染時間的長短與誘導發狀根的數量密切相關,菌株與外植體接觸時間長,則在外植體傷口處侵害細胞,最終導致外植體死亡;接觸時間短,則菌株無法完全感染細胞。本研究采用共培養法,利用農桿菌株A4分別侵染黃花敗醬的外植體0、2、4、6、8、10 min后放置,25 d后觀察發狀根的誘導情況,計算誘導率。由圖3可以看出,黃花敗醬的發狀根隨著侵染時間的增加誘導率也逐漸升高,最佳的誘導時間為8 min,平均誘導率達到最高77.79%。侵染10 min后誘導率逐漸下降,侵染的外植體有蔫腐變黃現象出現。所以，8～10 min為黃花敗醬的最佳侵染時間。

表2 不同發根農桿菌對不同外植體上黃花敗醬毛狀根的誘導效果

圖3 不同侵染時間對黃花敗醬毛狀根誘導率的影響

2.4 預培養和共培養對黃花敗醬發狀根誘導率的影響

2.4.1 預培養對黃花敗醬發狀根誘導率的影響 在農桿菌侵染前對植體外植體進行預培養處理,可使植物受體形成并釋放酚類信號分子,從而提高轉化率,同時能較好地解決褐化問題。本研究中,對黃花敗醬分別進行0、12、24、48、60 h的預培養后用農桿菌A4菌株侵染外植體,25 d后統計誘導出的發狀根數,計算誘導率。從圖4我們可以看出,預培養時間不同對外植體毛狀根的誘導率也顯著不同。本實驗中預培養時間在48 h時誘導率最高為79.17%,預培養60 h后誘導率開始明顯下降。

2.4.2 共培養對黃花敗醬發狀根誘導率的影響 共培養時間在植物毛狀根的誘導過程具有重要影響。共培養時間過長,外植體的轉化越難以實現;共培養時間過短,發根農桿菌中的基因片段不能及時的被整合到植物DNA上[12]。本研究中,對黃花敗醬的莖段分別進行0、12、24、48、60 h共培養,然后統計誘導出的發狀根總數,計算誘導率。從圖4可以看出,不同的共培養時間對黃花敗醬毛狀根的誘導率存在顯著差異。實驗結果表明最佳的共培養時間為48 h,誘導率高達84.33%,而預培養60 h后其誘導率開始下降。

圖4 預培養與共培養時間對黃花敗醬發狀根的影響

2.5 發狀根的PCR分子檢測結果 A4、15834、1601、1000發根農桿菌所誘導的黃花敗醬毛狀根中,A4菌株的誘導率最高,且生長期短,能進行液體擴增培養。本研究中,將根系發達、分支較多、生長狀況好的發狀根、植物根和A4菌株中的DNA進行PCR分子檢測并拍照(125V電壓,25 min)。由圖5可以看出,在外植體發狀根條帶(485 bp)處出現了與基因引物相同的條帶,自然狀態生長的根(未轉化)則未出現此條帶,表明發根農桿菌A4菌株中質粒DNA片段已整合進入轉化根的基因組中。

圖5 黃花敗醬發狀根PCR檢測結果

注：M.Marker 2000;1.正常根;2.質粒DNA;3.誘導根

2.6 黃花敗醬液體培養基篩選 使用不同種類的液體培養基對毛狀根的生長增殖狀態影響也不相同。本實驗經過25 d后觀察統計,毛狀根在MS液體培養基中生長迅速,轉化根系發達并具許多細小的分枝,而且增殖倍數最高為21.8倍,其他培養基中增殖倍數依次為B5(18.7倍)、1/2MS(16.5倍)、R2(10.4倍)。由此可見MS液體培養基更適合用于黃花敗醬毛狀根增殖的培養。如圖6所示。

表3 不同pH對黃花敗醬毛狀根的影響

圖6 培養基種類對黃花敗醬毛狀根生長的影響

2.7 不同pH對毛狀根的影響 毛狀根增殖培養的液體培養液,因培養液的pH值不同,毛狀根的增殖量也不同,一般認為酸性pH值對某些農桿菌Vir區基因有激活的作用,pH值一般在5.0～6.0時,有利于農桿菌的轉化,由表3可知,黃花敗醬毛狀根在液體培養基中,當pH為6.0時增殖量達到最大,生長較旺盛;當pH值大于6.0時,毛狀根增殖量開始逐漸減少,當pH達到8時,毛狀根開始出現老化,停止生長。

圖7 蔗糖濃度不同對黃花敗醬發狀根生長增殖的影響

2.8 不同濃度的蔗糖對發狀根增殖的影響 植物外植體在固體MS培養基中誘導出發狀根后,為了使其能進行擴增培養,一般將其剪切放置液體培養基中進行懸浮培養,本實驗選用MS液體培養基,為了研究不同濃度的碳源對發狀根的增殖和和次生代謝產物的含量有什么不同的影響,試驗操作過程中在MS液體培養基中分別加入濃度為5 g/L、10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L的蔗糖,25 d后稱取發狀根鮮重。實驗結果如圖7,圖8所示,蔗糖濃度在40 g/L時,毛狀根的增殖量平均最多達到20.93倍。而在50 g/L濃度時增殖倍數呈現下降趨勢,其增殖倍數為15.09,由此在MS液體培養基中加入40 g/L蔗糖濃度為最佳。

圖8 黃花敗醬發狀根的增殖

注：a.發狀根;b.發狀根增殖;c.干燥的發狀根

2.9 黃花敗醬毛狀根總黃酮含量測定 根據總黃酮的標準曲線y=0.065 6x+0.000 6,相關系數r為0.999 6,按照總黃酮含量公式計算出黃花敗醬毛狀根、自然根中總黃酮的含量分別為9.12%、7.89%。黃花敗醬毛狀根中總黃酮的含量是自然根的1.16倍。

2.9.1 陽性藥的篩選 經反復實驗得知,抑菌圈的直徑要適度,直徑過小,增大實驗誤差;直徑過大,抑菌圈會覆蓋到相鄰紙片處,影響測量的準確度[13]。結果見表4。由實驗結果顯示,抑制金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的最佳陽性藥為頭孢曲松鈉注射液(1.00 mg/mL)。

表4 不同陽性藥的抑菌圈直徑

2.9.2 黃花敗醬發狀根提液的抑菌作用考察 經過抑菌培養,與陽性藥抑菌圈直徑大小的對比結果,最終發現黃花敗醬發狀根總黃酮粗提取液在金黃色葡萄球菌的培養基中,其抑菌圈較圓且抑菌直徑較大,有明顯的抑菌作用,而在沙門氏菌的培養基中抑菌圈直徑很小且抑菌圈模糊不清,說明作用一般,對大腸桿菌幾乎沒有抑制作用。其中總黃酮提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌率為40.6%,對沙門氏菌抑菌率為7.2%。結果見表5,圖9。對金黃色葡萄球菌的抑菌率比沙門氏菌高出5.63倍。

表5 黃花敗醬發狀根總黃酮粗提液對幾種微生物的抑菌圈直徑

圖9 總黃酮粗提液抑菌效果

注：a.對金黃色葡萄球菌的抑制;b.對沙門氏菌的抑制。1.陽性藥抑菌圈;2.黃酮抑菌圈;3.對照組抑菌圈

3 討論

本實驗在選用種子消毒劑為4%次氯酸和0.1%升汞,兩種消毒劑均能對其起到消毒作用,但對比來看4%次氯酸的作用效果能佳,故在之后的實驗過程中,均采取此方法。發根農桿菌1601，15834，1000，A4,均能誘導黃花敗醬外植體產生發狀根，但是A4誘導出的發狀根粗壯且長勢較好,發狀根誘導率最高為79.17%。在預培養和共培養均為48 h,侵染8 min,發狀根誘導率為83.33%本研究通過PCR檢測A4中Ri質粒T-DNA的生根基因已整合進入黃花敗醬發根基因組中,在發根擴大培養中,在液體MS培養基pH值為6時中加入40 g/L蔗糖時最適合發根的擴大培養。最終測得黃花敗醬毛狀根中總黃酮的含量是自然根中黃酮含量的1.16倍,且總黃酮提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌率比沙門氏菌高出5.63倍。

[1]李玉基,張淑娜,李潔,等.黃花敗醬草對小鼠肝癌細胞血道轉移的影響[J].食品與藥品,2013,15(4):248-250.

[2]楊柳,姜海.黃花敗醬草化學成分和藥理作用的研究進展[J].中醫藥信息,2012,29(4):169-172.

[3]高亮,張琳,劉江云,等.黃花敗醬的化學成分研究[J].中草藥,2011,42(8):1477-1480.

[4]張舒娜,邵財,張浩,等.黃花敗醬不同居群的形態多樣性分析[J].吉林中醫藥,2014,34(7):710-712.

[5]王盈.黃花敗醬的化學成分及藥理作用研究進展[J].齊魯藥事,2009,28(4):222-225.

[6]譚超,孫志良,周可炎,等.黃花敗醬化學成分及鎮靜抑菌作用研究[J].中獸醫醫藥雜志，2003(4):3-5.

[7]HuangY,SuCY,KuoHJ,et al.A comparison of strategies for multiple-gene co-transformation via hairy root induction[J].Appl Microbiol Biotechnol,2013,97(19):8637-8647.

[8]張來,羅正偉,張顯強,等.發根農桿菌Ri質粒的特征及其應用[J].安徽農業科學,2010,38(15):8183-8185.

[9]陳偉莉,牟旭鵬,劉冬影.毛狀根在植物次生代謝產物生產方面應用的研究進展[J].黑河學院學報,2010,1(4):122-126.

[10]張淑麗,張天柱,楊世海.水飛薊發狀根培養體系的建立及其水飛薊賓含量的測定[J].中國中藥雜志,2014,39(11):2005-2010.

[11]唐浩國,單方方,魏曉霞,等.牡丹葉總黃酮抑菌活性研究[J].時珍國醫國藥,2009,20(6):1355-1357.

[12]張海弢,包京姍,楊世海,等.王不留行毛狀根的誘導及培養[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(6):141.

[13]佟春蘭,包海鷹,圖力古爾.蒙古口蘑子實體石油醚提取物的化學成分及抑菌活性[J].菌物學報,2010,29(4):619-624.

(2015-08-12收稿 責任編輯：王明)

熱烈慶?！妒澜缰嗅t藥》雜志第二屆編輯委員會編委黃璐琦教授被評為中國工程院院士

2015年12月7日，中國工程院公布了2015年院士增選名單，《世界中醫藥》雜志編委黃璐琦教授當選醫藥衛生學部院士，同時也是今年年齡最小的院士。黃院士是中藥資源與鑒定專家，中國中醫科學院常務副院長，首席研究員，中藥資源中心主任，全國中藥資源普查試點工作專家指導組組長，科技部重點領域中藥資源創新團隊負責人，部局共建道地藥材國家重點實驗室(培育基地)負責人，曾任國家973計劃項目首席科學家。黃院士以第一作者或通訊作者發表論文371篇，包括PNAS，JACS等SCI文章86篇，獲國家發明專利11項。黃院士為中醫藥事業的發展做出了突出貢獻，影響巨大，院士稱號實至名歸。

喜訊傳來，《世界中醫藥》雜志社倍感驕傲和自豪，黃院士作為雜志社的編委，必將擴大《世界中醫藥》雜志的影響力，提升雜志的整體形象，對雜志創品牌期刊具有十分重要的意義。

Establishment of Culturing System for Patrinia scabioscaefolia Fisch Hairy Roots and the Evaluation of Antibacterial Effect

Zhao Xue1,2,3, Kong Weijun2, Ma Xinyue1, Chang Guiying1, Dong Changying1, Yang Shihai3

(1JilinAgriculturalScienceandTechnologyCollege,Jilin132101,China; 2InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicinalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100193,China; 3JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)

Objective:To establish the hairy roots culture system of Patrinia scabioscaefolia Fisch and analyze the flavone content in hairy roots culturing system and its antibacterial role of basic research.Methods:Hairy root of Patrinia scabioscaefolia Fisch were induced by the infection of four Agrobacterium rhizogenes strains: R15834, R1601, R1000, and A4. The infecting time, pre-culture and co-culture time on growth of hairy root were studied, and the hairy roots were detected by PCR. The purity of flavone was determined by UV, and determination of inhibition was tested by disk diffusion method.Results:The highest induction frequency was obtained from stem segment with 48 h pre-culture and co-culture which were induced by A4 for 8 min. The transformation frequency and proliferation rate could be raised by culture media with sucrose concentration of 40 g/L. The PCR examination result showed that rolB genes were successfully inserted into the hairy roots of Patrinia scabioscaefolia Fisch.Conclusion:Hairy root of flavonoids content is higher than that of the natural content and that the aqueous extrats had obvious antibacterial effect against Staphylococcus aureus.

Patrinia scabioscaefolia Fisch; Agrobacterium rhizogenes; Hairy root; Antibacterial effect

吉林省教育廳“十二五”科學技術研究規劃項目(編號:吉教科合字[2015]第376號);長白山重點實驗室培育項目(編號:吉農院合字[2013]第S001號)

趙雪(1982.1—),男,醫學碩士,講師,研究方向:中藥學,E-mail:yingxiongxiaoxue@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.12.032