酒曲中產(chǎn)酯酵母的分離篩選

萬世旅，李光輝，鐘姝霞，邊名鴻

(1.四川理工學院生物工程學院，四川 自貢 643000;2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川 自貢 643000)

引言

產(chǎn)酯酵母又稱生香酵母，是可生成較多酯類物質(zhì)的酵母通稱，分屬于漢遜酵母屬，產(chǎn)朊酵母屬、假絲酵母屬、球擬酵母屬和酒香酵母屬等，是中國白酒中酯香的主要產(chǎn)生菌。產(chǎn)酯酵母主產(chǎn)乙酸酯類，特別是乙酸乙酯［1-3］。

小曲酒是我國白酒的主要酒種之一，在四川、貴州、云南、江西、湖北和湖南等省有廣泛的分布。隨著小曲白酒生產(chǎn)工藝技術(shù)的改革和科研的進步，小曲酒的質(zhì)量有了一定提高，但仍普遍存在放香不足等問題［4］。乙酸乙酯作為小曲白酒的主體香味成分，其含量對于小曲酒的質(zhì)量有著重要影響，因此，篩選產(chǎn)乙酸乙酯能力強，產(chǎn)酯豐富并且適合小曲酒生產(chǎn)的酵母，可以為小曲的制曲提供優(yōu)良的菌種，提高小曲質(zhì)量，改善小曲酒酒質(zhì)，促進小曲酒的發(fā)展，同時提高小曲酒生產(chǎn)企業(yè)的經(jīng)濟效益和市場競爭力［5］。

傳統(tǒng)酒曲中含有大量釀酒有益微生物，包括優(yōu)良糖化菌、酵母菌等，本文從優(yōu)質(zhì)釀造酒曲中篩選產(chǎn)酯酵母，并以高粱酶解液作為培養(yǎng)基研究其產(chǎn)酯情況，以期獲得適于小曲酒釀造的優(yōu)良產(chǎn)酯酵母。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品及菌種來源

樣品:8種來源于川西南片區(qū)不同區(qū)域的釀造酒曲，其中，5種大曲，3種小曲。

對比菌株:產(chǎn)酯酵母Njsys-SYT由實驗室分離培養(yǎng)并保存。

1.1.2 主要試劑

氫氧化鈉、醋酸鈉、氯化鉀、硫酸、無水乙醇、酚酞、氯化鈉、葡萄糖、瓊脂粉(分析純，成都科龍化工);糖化酶、淀粉酶、蛋白胨、酵母浸膏(北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司);三丁酸甘油酯(阿拉丁試劑(上海)有限公司);鏈霉素、青霉素、土豆、高粱(市售)。

1.1.3 培養(yǎng)基

產(chǎn)香初篩培養(yǎng)基:馬鈴薯20%，蔗糖2%，瓊脂2%，三丁酸甘油酯0.4%，pH自然(涂布時培養(yǎng)基中加入60 mg/L的青霉素抑制細菌生長，在溫度40℃左右時，添加搖勻)。

菌種活化培養(yǎng)基:葡萄糖2%，酵母膏1%，蛋白胨2%，pH自然。

發(fā)酵產(chǎn)酯培養(yǎng)基［6］:取150 g高粱粉于2 L燒杯中，加入少量自來水，攪成糊狀，再加熱水600 mL，攪勻，調(diào)pH值為6.0～6.5，加入α-淀粉酶和糖化酶經(jīng)液化和糖化后取上清液將其糖度調(diào)到8°Bx備用。

1.1.4 主要儀器

E100生物顯微成像系統(tǒng)(日本NIKON公司)，UV-200紫外可見分光光度計(上海尤尼柯有限公司)，PHJ-02型pH計(上海精密科學儀器有限公司)，BS-2F數(shù)控恒溫搖床培養(yǎng)箱(常州精成國華儀器有限公司)，MJ-250生化培養(yǎng)箱(上海齊欣科學儀器有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵母的分離純化

稱取5 g酒曲樣品，加入裝有45 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，150 r/min振蕩30min，充分搖勻。取5 mL上清液加入45 mL麥氏培養(yǎng)液三角瓶中30℃搖床富集培養(yǎng)24 h，經(jīng)梯度稀釋后涂布，依次挑取有透明圈的單菌落，經(jīng)多次平板劃線純化后，通過顯微鏡觀察是否為純種菌落，將純菌種移入試管斜面，冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?不純的繼續(xù)分離劃線，直至純化為止。

1.2.2 產(chǎn)酯酵母初篩

將從曲樣中分離得到的產(chǎn)酯酵母菌和對比菌株Njsys-SYT采用點種的方式接種到產(chǎn)香初篩培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)48 h，每株菌設(shè)計3個平行對照組，測量菌落直徑d，透明圈直徑D，計算D/d值，選擇D/d值較大的作為復篩出發(fā)菌株。

1.2.3 產(chǎn)酯酵母復篩

對復篩菌株進行活化，接種在液體活化培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)24 h后，將細胞數(shù)稀釋到108個/mL，按10%的量接種于裝有100 mL發(fā)酵產(chǎn)酯培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃恒溫靜置培養(yǎng)4 d，每株菌設(shè)計3個平行對照組，檢測總酯含量，總酯的測定采用皂化回流法［7］。同時將這幾株菌制作成純種酵母曲測定其對四大酯催化生產(chǎn)能力:稱取相當于5 g干曲的曲量加入100 mL含1%相應(yīng)有機酸和20%乙醇的酯化體系中32℃酯化100 h，加水50 mL蒸餾，接溜出液100 mL測定相應(yīng)酯含量［8］。

1.2.4 產(chǎn)酯酵母的耐受性研究

耐酒精試驗:在酒精濃度為0%，6%，8%，10%，12%，14%的YEPD液體培養(yǎng)基中接入菌種，120 rpm搖床培養(yǎng)24 h后測定600 nm波長下的吸光值，濃度大的菌液可以作適當稀釋，使其測得OD值在0.10～0.80以內(nèi)，經(jīng)稀釋后測得的OD值乘以稀釋倍數(shù)，即為培養(yǎng)液實際的 OD 值［9］。

耐熱試驗:分別將接有菌種的培養(yǎng)基置于30℃、34℃、36℃、38℃和40℃下120 rpm振蕩培養(yǎng)24 h后，測定600 nm波長下的OD值。

耐酸性試驗:用鹽酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基 pH 為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，接入酵母菌懸液，30 ℃、120 rpm 搖床培養(yǎng)24 h后，測定600 nm波長下的OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母的分離純化

采用傳統(tǒng)分離手段對酒曲中酵母菌進行分離，將富集后的酒曲菌懸液經(jīng)過涂布、劃線后共分離出31株酵母菌株，其中有透明圈的產(chǎn)酯酵母有18株，菌落大多呈乳白色，表面較濕潤粗糙，中央平坦邊緣整齊，細胞多呈圓形。透明圈明顯的代表性菌株如圖1所示。

圖1 部分菌落與菌體形態(tài)

2.2 產(chǎn)酯酵母的初篩

將從曲樣中分離得到的18株產(chǎn)酯酵母及對比菌株Njsys-SYT接入產(chǎn)香初篩培養(yǎng)基上。通過測量酵母菌落直徑d、透明圈直徑D，計算其比值D/d，通過D/d值的大小來表征酵母菌酯化酶活力的高低，結(jié)果如圖2所示。

對比菌株Njsys-SYT是實驗室保存的一株優(yōu)良產(chǎn)酯酵母菌，因此考慮以Njsys-SYT為參考，選擇D/d≥3.0作為復篩條件，由圖 2可知，Y1、Y2、Y4及 Y6的D/d值均大于3.0，因此選擇這4株菌作為復篩出發(fā)菌株，進一步研究其產(chǎn)酯化酶能力。

2.3 產(chǎn)酯酵母的復篩

將 Y1、Y2、Y4、Y6 及 Njsys-SYT 5 株菌株進行發(fā)酵，測定其總酯含量，并將其制作成純種酵母曲考察其對己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯的催化生成能力。結(jié)果分別如圖3和圖4所示。

圖3 復篩酵母的產(chǎn)總酯結(jié)果比較

圖4 復篩酵母的四大酯催化生成能力比較

從圖3中可知，在相同的條件下，酵母Y2、Y4和Njsys-SYT產(chǎn)酯效果較好，其中酵母Y2產(chǎn)酯能力突出，發(fā)酵液中總酯含量達到3.273 g/L，酵母Y4和Njsys-SYT的發(fā)酵液中總酯含量分別也達到2.042 g/L和2.129 g/L。

由圖4可知，5株酵母均對乙酸乙酯有很高的催化生產(chǎn)能力，其次是己酸乙酯，其中酵母Y2對這兩種酯的催化能力最強，其催化生成乙酸乙酯和己酸乙酯的量達到2.731 g/L和1.921 g/L;5株酵母對己酸的催化能力高于對乳酸的催化能力，這與產(chǎn)酯酵母有升己酸乙酯，降乳酸乙酯作用的研究報道相符［10］。綜上分析，酵母Y2在液態(tài)和固態(tài)發(fā)酵下都有較強的酯化能力，可作為一株優(yōu)良的產(chǎn)酯酵母。

2.4 產(chǎn)酯酵母生長特性研究

小曲酒釀造環(huán)境(高酒精濃度、低pH及高溫)對產(chǎn)酯酵母影響較大，因此需要研究產(chǎn)酯酵母在不同條件的生長情況，以考察菌種對酒精、溫度及酸度的耐受性。

2.4.1 酒精濃度對菌株生長的影響

將酵母菌懸液接種于酒精含量分別為0%，6%、8%、10%、12%、14%的YEPD液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)24 h后，測定其在600 nm的菌體濃度，結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同酒精含量下Y2菌株的生長情況

由圖5可以看出菌株的生長隨著酒精濃度的升高而受到嚴重影響。菌株Y2能耐受10%的酒精環(huán)境，有較高的耐酒精能力，這樣在白酒發(fā)酵后期，酒精的積累對菌株Y2的影響相對會較小，有利于香味物質(zhì)的合成。

2.4.2 耐熱性試驗

將酵母菌懸液接種于YEPD液體培養(yǎng)基中，分別置于30℃，34℃，36℃，38℃，40℃下120 rpm振蕩培養(yǎng)24 h后，測定其在600 nm波長下的菌體濃度，結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同溫度下Y2菌株的生長情況

小曲白酒因為發(fā)酵周期短，因此在發(fā)酵過程中升溫幅度較大。耐高溫的產(chǎn)香微生物有利于代謝產(chǎn)物的積累，同時，溫度影響微生物細胞內(nèi)生物大分子(如蛋白質(zhì)和核酸)的穩(wěn)定性、細胞膜的流動性等方面［11］，溫度變化能夠?qū)е录毎て茐摹⒋x活動減弱，影響細胞生長。由圖6可知，菌株Y2在38℃仍有一定的生長，有較強的耐熱性。

2.4.3 耐酸性試驗

將酵母菌懸液接種于 pH 值分別為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的YEPD液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)24 h后，測定其在600 nm的菌體濃度，結(jié)果如圖7所示。

圖7 不同pH條件下Y2菌株的生長情況

小曲酒發(fā)酵周期短，產(chǎn)酸快，釀酒過程pH值較低，因此對微生物耐酸性要求很高。同時pH值變化能使微生物細胞中的電解質(zhì)發(fā)生變化，從而影響微生物的生長代謝［12］。由圖7可知，Y2酵母菌株在pH值為2的情況下生長依然旺盛，可見該菌株耐酸性能很好。

3 結(jié)束語

本文從不同酒曲樣品中分離純化出有產(chǎn)酯能力的酵母菌18株，通過初篩、復篩，得到一株產(chǎn)乙酸乙酯能力較強的酵母 Y2，其在高粱糖化液中總酯產(chǎn)量為3.273 g/L，在100 mL的酯化體系中催化生成乙酸乙酯和己酸乙酯的量為2.731 g/L和1.921 g/L。該酵母菌能在酒精濃度10%、pH2.0、溫度為38℃的條件下生長，具有良好的耐酒精、耐酸和耐熱能力，是一株優(yōu)良的產(chǎn)香酵母，在改善小曲酒風味及穩(wěn)定酒的質(zhì)量有較好的應(yīng)用前景。

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