復(fù)方益氣止咳顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

汪 晶，吳曉燕

(1.江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京 210028；2.南京市鼓樓醫(yī)院，江蘇 南京 210046)

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復(fù)方益氣止咳顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

汪 晶1，吳曉燕2*

(1.江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京 210028；2.南京市鼓樓醫(yī)院，江蘇 南京 210046)

目的：建立復(fù)方益氣止咳顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用雙波長高效液相色譜法(HPLC)同時測定顆粒中毛蕊異黃酮葡萄糖苷及橙皮苷的含量；采用薄層色譜法(TLC)對方中黃芪、陳皮、白術(shù)成分進(jìn)行定性鑒別。結(jié)果：薄層鑒別的色譜斑點(diǎn)清晰，陰性對照無干擾；毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷分別在5.5～220μg·mL-1、10.7～428μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為94.5%、102.34%。結(jié)論：該方法具有簡便、準(zhǔn)確及專屬性強(qiáng)的特點(diǎn)，可用于復(fù)方益氣止咳顆粒的質(zhì)量控制。

橙皮苷；黃芪甲苷；白術(shù)；薄層色譜；高效液相色譜；質(zhì)量控制

復(fù)方益氣止咳顆粒是由黃芪、陳皮、白術(shù)、雞內(nèi)金等中藥飲片加工制備的顆粒劑，處方源于醫(yī)院臨床經(jīng)驗方，具有健脾補(bǔ)肺、化痰止咳、益氣固表的作用，療效顯著，主治脾肺氣虛之證，如臨床咳嗽痰多、氣喘、食少納呆、腹脹便溏等多見癥狀。本研究采用薄層色譜法對方中黃芪、陳皮、白術(shù)成分進(jìn)行了定性鑒別，同時采用高效液相色譜法對制劑中毛蕊異黃酮葡萄糖苷及橙皮苷進(jìn)行含量測定，為進(jìn)一步提升該制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀；Sartorius BP211D電子分析天平；硅膠G薄層板(青島海洋化工10cm×10cm；10cm×20cm)；超聲儀AS3120A(天津奧特賽恩斯)；水浴鍋(鄭州科創(chuàng)儀器有限公司)；暗箱紫外分析儀(上海精科實業(yè)有限公司)。

1.2 材料

黃芪甲苷(批號110781-200813)，橙皮苷(批號110721-201011)，毛蕊異黃酮葡萄糖苷(批號：111920-201004)，白術(shù)對照藥材(批號120925-201003)，均購于中國食品藥品檢定研究院；復(fù)方益氣止咳顆粒(三批,批號140511；140518；140525，院內(nèi)自制)；乙腈(美國天地)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC薄層鑒別

2.1.1 黃芪 取本品顆粒6g，平行三份操作，加甲醇50mL，超聲提取30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10mL，加熱使溶解，待冷卻后加入水飽和正丁醇振搖提取3次，每次30mL，合并正丁醇液，正丁醇液加濃氨試液洗滌2次，每次20 mL，棄去洗滌液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1mL使溶解，作為供試品溶液。按供試品溶液制備方法制備無黃芪藥材的陰性對照溶液；精密稱取黃芪甲苷對照品，加入甲醇制成1mg·mL-1的對照品溶液。按薄層色譜法《中國藥典》(2010版)一部附錄(附錄VIB)試驗，吸取上述供試品溶液、陰性對照溶液及黃芪甲苷對照品各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以10℃以下放置的三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)下層溶液為展開劑，展開，展距12cm，取出，晾干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，于105℃加熱3～5min至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果顯示：在供試品色譜中，與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的橙黃色熒光斑點(diǎn)，陰性樣品無斑點(diǎn)[1-2]。薄層色譜見圖1。

1.對照品(對照藥材)；2.樣品140511；3.樣品140518；

2.1.2 陳皮 取本品顆粒6g，平行三份操作，加甲醇50mL，超聲提取30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇10mL使溶解，作為供試品溶液；按供試品溶液制備方法制備無陳皮藥材的陰性對照溶液；精密稱取橙皮苷對照品，加入甲醇制備0.5mg·mL-1的對照品溶液；按照薄層色譜法《中國藥典》(2010版)一部附錄(附錄VIB)試驗，吸取上述供試品溶液、陰性對照溶液及橙皮苷對照品各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(100∶17∶13)為展開劑，展開4cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20∶10∶1∶1)上層溶液為展開劑，展至約10cm，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈(365nm)下檢視。結(jié)果顯示：在供試品色譜中，與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性樣品無斑點(diǎn)[3]。薄層色譜見圖1。

2.1.3 白術(shù) 取本品顆粒6g，平行三份操作，加甲醇50mL，回流提取30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20mL使溶解，水溶液加入正己烷萃取2次，每次20mL，合并正己烷萃取液，蒸干，殘渣加甲醇2mL使溶解，作為供試品溶液；同法制備白術(shù)對照藥材溶液及缺白術(shù)藥材陰性對照品溶液。按照薄層色譜法《中國藥典》(2010版)一部附錄(附錄VIB)試驗，吸取上述對照藥材溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯(10∶3)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃下加熱，置紫外光燈(365nm)下檢視。結(jié)果顯示：在供試品色譜中，與白術(shù)對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，而陰性樣品無斑點(diǎn)[4-5]。薄層色譜見圖1。

2.2 HPLC含量測定

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 采用Waters C18(250mm×4.6mm, 5μm)色譜柱；以乙腈(A)-0.4%乙酸水(B)為流動相，按表1進(jìn)行梯度洗脫，流速1mL·min-1，檢測波長為260nm、280nm，柱溫30℃。在該色譜條件下，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的保留時間為21.2min，橙皮苷的保留時間為33.16min，分離度均大于1.5，樣品中其他成分對其測定無干擾。色譜見圖2。

表1 梯度洗脫

A.對照品色譜圖；B.樣品色譜圖；1.毛蕊異黃酮葡萄糖苷；2.橙皮苷

圖2 HPLC液相色譜

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖及橙皮苷對照品適量，加甲醇制備毛蕊異黃酮葡萄糖苷濃度為220μg·mL-1、橙皮苷濃度為428μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品顆粒，研細(xì)，稱量2g顆粒，精密稱定，至25mL中具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇，超聲提取60min，放冷至室溫，精密稱定，補(bǔ)足揮發(fā)的甲醇量，過濾，取續(xù)濾液，微孔濾膜過濾，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品溶液0.25、0.5、1.0、2.0、5.0mL至10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成不同濃度對照品溶液，分別精密吸取不同濃度對照品及混合對照品母液10μL，進(jìn)樣測定，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對照品質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

2.2.5 精密度試驗 精密吸取毛蕊異黃酮葡萄糖苷及橙皮苷對照品溶液10μL，在上述色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣6次，分別測定其峰面積，結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷及橙皮苷峰面積的RSD(n=6)分別為0.93%、0.87%。結(jié)果表明精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批樣品，按“2.2.3”項供試品溶液方法平行制備供試品溶液6份，在上述色譜條件下分別進(jìn)樣測定，結(jié)果供試品供試品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷平均質(zhì)量濃度為12.4μg·mL-1，RSD為1.27%；橙皮苷的平均質(zhì)量濃度為153μg·mL-1，RSD為1.35%。 結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，在上述色譜條件下進(jìn)樣測定，其中，毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD(n=6)為2.10%；橙皮苷峰面積的RSD(n=6)為1.96%。結(jié)果表明：供試品溶液中毛蕊異黃酮葡萄糖苷及橙皮苷在室溫條件下24h內(nèi)測定結(jié)果穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率試驗 取1g顆粒，精密稱定，加入至10mL容量瓶中，分別精密加入含有等量對照品成分的溶液，按“2.2.3”項方法制備供試品溶液，平行6份，分別精密吸取上述供試品溶液各10μL，在上述色譜條件下進(jìn)行測定，計算回收率和RSD。結(jié)果顯示：毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均回收率為94.5%，RSD為3.23%；橙皮苷的平均回收率為102.34%，RSD為2.17%。

2.2.9 樣品含量測定 取3批顆粒樣品，按“2.2.3”項方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣測定，每批次平行3份。計算每批次樣品中指標(biāo)性成分的質(zhì)量濃度。結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果

3 討論

通過對毛蕊異黃酮葡萄糖苷[6]及橙皮苷進(jìn)行紫外掃描圖譜分析，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的最大吸收波長為260nm，橙皮苷的最大吸收波長為283nm；采用單波長直接測定兩種成分結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在260nm條件下，橙皮苷峰形較差；在283nm條件下，樣品中其他成分影響毛蕊異黃酮葡萄糖苷的測定，故采用雙波長檢測方法同時測定兩種成分含量[7]。

黃芪為方中君藥，傳統(tǒng)質(zhì)控指標(biāo)為皂苷類成分，對其黃酮類物質(zhì)質(zhì)量控制研究較少，本研究采用HPLC同時測定黃芪中黃酮類成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷及陳皮中橙皮苷的含量；同時采用薄層色譜法建立了復(fù)方益氣止咳顆粒中黃芪、陳皮、白術(shù)三種飲片的鑒別方法，結(jié)果準(zhǔn)確、方便，重現(xiàn)性好，為全面建立復(fù)方益氣止咳顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了參考依據(jù)。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].一部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:283.

[2] 張玉東，徐士云. 益氣養(yǎng)血口服液中黃芪的薄層色譜鑒別法探討[J].中成藥，2007，29(10):1560-1561.

[3] 戴敬,楊曉婧,郝培培,等.女金丸薄層色譜鑒別方法研究[J].中成藥,2010,32(11):2021-2025.

[4] 李偉,文紅梅,崔小兵,等.白術(shù)的化學(xué)成分研究[J].中草藥，2007，38(10):1460-1462.

[5] 壽旦,俞忠明,章建民.改良的白術(shù)藥材薄層色譜鑒別研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2011,29(3):535-537.

[6] 石子儀,鮑忠,姜勇,等.不同來源黃芪藥材中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花素的定量分析[J].中國中藥雜志,2007,32(9):779-783.

[7] 孫冬梅,畢曉黎,胥愛麗,等.HPLC法測定不同產(chǎn)地陳皮藥材中橙皮苷的含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2009,15(11):1-3.

(責(zé)任編輯：李嵐春)

Study on Quality Standard of Fufang Yiqi Zhike Granule

Wang Jing1,Wu Xiaoyan2*

(1.Jiangsu Provincial Academy of Chinese Medicine, Nanjing 210000,China; 2.Nanjing Drum Tower Hospital,Nanjing 210000,China)

Objective:To establish a quality standard for Yiqi Zhike Granule.Methods:Radix Astragali, Citri Reticulatae Pericarpium and Atractylodis Macrocephalae Rhizoma were identified by thin layer chromatography(TLC). Calycosin 7-O-β-D-Glucopyranoside and Hesperidin were determined by high performance liquid chromatography(HPLC). Results:TLC chromatographic spots were clear, without the interference of negative control.Calycosin 7-O-β-D-Glucopyranoside and Hesperidin were separated well and the linearity range of them were 5.5～220μg·mL-1, 10.7～428μg·mL-1, the average recovery were 94.5%, 102.34% respectively.Conclusion:the method was simple, accurate and with good specificity, which can be used for the quality control of the Yiqi Zhike Granule.

Hesperidin; Astragaloside; Atractylodis;TLC; HPLC;Quality Control

2015-09-17

國家自然科學(xué)基金(81403121)

汪晶(1986-)，男，江蘇省中醫(yī)藥研究院實習(xí)研究員，研究方向為中藥學(xué)。E-mail：wangjing3968@gmail.com

吳曉燕(1983-)，女，南京市鼓樓醫(yī)院藥師，研究方向為藥劑學(xué)。E-mail：wxypharmacy@126.com

R284

A

1673-2197(2015)22-0017-03

10.11954/ytctyy.201522007