化療藥物順鉑和阿霉素聯(lián)合應(yīng)用體外研究

包麗娜，包永睿,2,3，孟憲生,2,3*，王 帥,2,3

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心，遼寧 沈陽 110074；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600)

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化療藥物順鉑和阿霉素聯(lián)合應(yīng)用體外研究

包麗娜1，包永睿1,2,3，孟憲生1,2,3*，王 帥1,2,3

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心，遼寧 沈陽 110074；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600)

目的：定量分析抗腫瘤藥物順鉑和阿霉素聯(lián)合應(yīng)用的協(xié)同、相加或拮抗作用，篩選順鉑和阿霉素聯(lián)合應(yīng)用的最佳配比。方法：不同配比的化療藥物順鉑和阿霉素處理HepG2細(xì)胞24h，MTT法測(cè)定HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用，Cbou-Talalay法計(jì)算藥物的聯(lián)合指數(shù)和兩種藥物對(duì)HepG2細(xì)胞的敏感性，分析藥物不同配比的相互作用，篩選順鉑和阿霉素聯(lián)合應(yīng)用的最佳配比。結(jié)果：順鉑、阿霉素單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率呈劑量依賴性量效關(guān)系；兩種藥物以小差別比例配伍時(shí)，小劑量聯(lián)合應(yīng)用呈現(xiàn)拮抗作用，大劑量聯(lián)合應(yīng)用呈協(xié)同作用；兩種藥物以大差別比例配伍時(shí)，聯(lián)合效應(yīng)結(jié)果相反；綜合藥物聯(lián)合指數(shù)和兩種藥物對(duì)HepG2細(xì)胞的敏感性，優(yōu)選出順鉑和阿霉素聯(lián)合應(yīng)用的最佳配比為1∶15。結(jié)論：化療藥物順鉑和阿霉素不同配比聯(lián)合應(yīng)用均可產(chǎn)生增強(qiáng)互補(bǔ)、減毒增效的作用。

順鉑；阿霉素；中效原理；聯(lián)合指數(shù)；聯(lián)合藥物敏感性

原發(fā)性肝癌為我國(guó)惡性腫瘤死亡率排名第二的疾病，臨床治愈率較低，多采用藥物治療。順鉑作用廣泛、抑瘤活性強(qiáng)，是用于治療惡性腫瘤的首個(gè)鉑類藥物， 阿霉素細(xì)胞毒性較大，為目前治療肝細(xì)胞癌最有效藥物之一[1]。順鉑和阿霉素聯(lián)合治療肝細(xì)胞癌為目前最常用的化療方案[2-5]，但臨床應(yīng)用時(shí)給藥比例不一致。本實(shí)驗(yàn)以肝癌細(xì)胞株HepG2為主要對(duì)象，在體外利用MTT法觀察順鉑和阿霉素單用或聯(lián)合應(yīng)用對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2增殖的影響，并利用中效原理篩選順鉑聯(lián)合阿霉素治療肝腫瘤的最佳配比。現(xiàn)具體報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞系HepG2，購(gòu)于上海細(xì)胞庫。順鉑為江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：130701；阿霉素為Actavis Italy S.p.A公司生產(chǎn)，批號(hào)：2QLO051，使用時(shí)用培養(yǎng)液配置并稀釋[6-8]。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，將細(xì)胞進(jìn)行1∶2傳代。

1.3 方法

1.3.1 藥物效應(yīng)檢測(cè) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，接種于無菌的96孔板中，使每孔細(xì)胞密度為5×103個(gè)，將孔板放于37℃恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。實(shí)驗(yàn)設(shè)藥物處理組、對(duì)照組和空白對(duì)照組。聯(lián)合用藥方案為：依據(jù)臨床化療方案給藥比例及兩種藥物IC50值設(shè)置藥物配比，分別為1∶1、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30。采用MTT法分別測(cè)定順鉑和阿霉素單獨(dú)給藥及聯(lián)合給藥對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

1.3.2 結(jié)果判定方法 依據(jù)中效原理方程式fa/fu=(D/Dm)m(fa：效應(yīng)，fu=1-fa，D：劑量，Dm：中效劑量)，計(jì)算藥物合用對(duì)HepG2細(xì)胞的敏感性及藥物各效應(yīng)的聯(lián)合指數(shù)CI[4-9]。fa即抑制率，計(jì)算公式：抑制率(fa)=(對(duì)照組吸光值-實(shí)驗(yàn)組吸光值)/對(duì)照組吸光值×100%。

m值越大，說明聯(lián)合藥物組的敏感性越高。CI=D1/DX1+D2/DX2+αD1D2/DX1DX2，D1、D2為藥物合用產(chǎn)生效應(yīng)的各自濃度，DX1DX2為藥物單用時(shí)達(dá)到相同效應(yīng)的濃度；兩種藥物作用機(jī)制相同α=1，兩藥作用機(jī)制不同α=0，順鉑和阿霉素作用機(jī)制不同，故α=0。CI<1，藥物的相互作用為協(xié)同作用；CI=1，藥物的相互作用為相加作用；CI>1，藥物的相互作用為拮抗作用。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

每份樣本平行測(cè)定3孔，每個(gè)藥物試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組比較，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析、直線回歸和相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 順鉑、阿霉素單獨(dú)應(yīng)用對(duì)HepG2細(xì)胞效應(yīng)

隨藥物濃度的梯度增加，藥物對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率也隨之增加。采用SPSS17.0軟件對(duì)logD、logfa/fu作直線回歸分析，計(jì)算兩種藥物單獨(dú)應(yīng)用的中效濃度Dm。結(jié)果見表1。

2.2 順鉑和阿霉素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)HepG2細(xì)胞效應(yīng)

根據(jù)中效原理方程式fa/fu=(D/Dm)m，采用SPSS17.0軟件對(duì)logD、logfa/fu作直線回歸分析，計(jì)算兩種藥物各配比合用時(shí)中效濃度Dm、對(duì)HepG2細(xì)胞敏感性(m值)及聯(lián)合指數(shù)CI，并繪制指數(shù)-效應(yīng)曲線。結(jié)果見表2、圖1。

表1 順鉑和阿霉素對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)

表2 各藥物組的直線回歸方程相關(guān)參數(shù)及m值、CI值

根據(jù)直線回歸方程中斜率m值的大小，可判斷出各配比組順鉑與阿霉素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)HepG2細(xì)胞的敏感性大小順序?yàn)?>4>5>6>2>1。由圖1可知，順鉑和阿霉素配比為1∶1、1∶5時(shí)，兩種藥物聯(lián)合指數(shù)隨劑量增大而增大，但1∶5配比兩藥合用產(chǎn)生協(xié)同作用的劑量范圍較大；順鉑和阿霉素配比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶30時(shí)，兩種藥物聯(lián)合指數(shù)隨劑量增大而減小，且1∶15、1∶20、1∶30組產(chǎn)生協(xié)同作用的劑量范圍均較大。由于三組協(xié)同作用差異較小，綜合考慮聯(lián)合藥物敏感性，順鉑和阿霉素聯(lián)合應(yīng)用的最佳配比為1∶15，其協(xié)同作用、敏感性均最強(qiáng)。

3 討論

人類肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種常見的惡性腫瘤，預(yù)后極差，為我國(guó)死亡率第二的惡性腫瘤。目前，臨床主要治療方法為手術(shù)切除，對(duì)于不能行手術(shù)切除的患者，可給予化療藥物治療[9]。順鉑和阿霉素是治療肝癌常用的一線化療藥物，臨床常聯(lián)合給藥。順鉑是周期非特異性藥物，阿霉素屬蒽環(huán)類化合物，兩藥合用無論是體內(nèi)還是體外均可產(chǎn)生協(xié)同作用，比藥物單獨(dú)化療有更好的效果，但臨床聯(lián)合化療時(shí)，藥物的配比并不固定[10]。

中效原理即Cbou-Talalay聯(lián)合指數(shù)法，是目前國(guó)內(nèi)外評(píng)價(jià)藥物相互作用公認(rèn)的方法，主要采用聯(lián)合指數(shù)(CI)評(píng)價(jià)藥物的相互作用，判斷藥物聯(lián)合應(yīng)用的協(xié)同或者拮抗作用，可定量反映藥物協(xié)同效應(yīng)的劑量范圍。聯(lián)合藥物敏感性即聯(lián)合應(yīng)用藥物對(duì)細(xì)胞的敏感程度，可反映不同配比藥物對(duì)癌細(xì)胞的敏感性。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)順鉑、阿霉素的臨床用藥劑量，并參考兩種藥物對(duì)HepG2細(xì)胞抑制率的IC50，選擇1∶1、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用。當(dāng)兩種藥物以小差別比例(1∶1、1∶5)配伍時(shí)，小劑量聯(lián)合應(yīng)用呈現(xiàn)拮抗作用，大劑量聯(lián)合應(yīng)用呈現(xiàn)協(xié)同作用；而兩藥以大差別比例(1∶10、1∶15、1∶20、1∶30)配伍時(shí)，聯(lián)合作用結(jié)果相反。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩個(gè)指標(biāo)分別篩選出的最優(yōu)配比不一致，故本實(shí)驗(yàn)在藥物相互作用為協(xié)同效應(yīng)的前提下，比較各比例配伍組的聯(lián)合藥物敏感性，優(yōu)選順鉑和阿霉素聯(lián)合應(yīng)用的最佳配比。因而，聯(lián)合用藥時(shí)可選擇最佳配伍比例達(dá)到最高效應(yīng)時(shí)的最小劑量進(jìn)行，盡可能增加兩藥的協(xié)同作用。

圖1 量效曲線

注：CI<1，協(xié)同作用；CI=1，相加作用；CI>1，拮抗作用。

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(責(zé)任編輯：李嵐春)

Studies of Chemotherapy Drugs Cisplatin and Doxorubicin Combined Application in Vitro

Bao Lina1,Bao Yongrui1,2,3,Meng Xiansheng1,2,3*,Wang Shuai1,2,3

(1.College of Pharmacy,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine;2.Liaoning Province Multi-Component Chinese Medicine Engineering Technology Research Center；3.Liaoning Province Modern TCM Research and Engineering Laboratory,Dalian 116600,China)

Objective:Quantitative evaluation of the relationship between anticancer drugs cisplatin and doxorubicin combined effect of screening the best ratio of combination therapy. Methods:Different ratios of cisplatin and gemcitabine's inhibition rates of HepG2 cells was measured by MTT assay. Utilize median-effect principle to calculate combination index and the sensitivity of the two drugs on HepG2 cells，and evaluate drug interactions.Results:Cisplatin and Adriamycin's inhibition rate of HepG2 cells in a dose-dependent relationship between dose no matter alone and in combination. Small doses of the drug combination, showing a synergistic effect，and high-dose combination is showing antagonism. Integrated drug combination index and the sensitivity of the two drugs on HepG2 cells，the best ratio optimized cisplatin and adriamycin is 1:15.Conclusion:Median-effect principle is often used to evaluate drug interactions in vitro, which evaluation can be combined with the drug, the best ratio of anticancer drugs combined screening applications.

Cisplatin；Doxorubicin；Median-effect principle；Combination index；Combining drug susceptibility

2014-12-04

國(guó)家“十二五”“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(2013ZX09507005)；遼寧省教育廳一般項(xiàng)目(L2014361)

包麗娜(1989-)，女，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)樗幬锓治觥-mail:976145703@qq.com

孟憲生 (1964-)，男，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教授，研究方向?yàn)橹兴幗M分配伍、代謝組學(xué)及藥品質(zhì)量分析。E-mail:mxsvvv @126.com

R737.31

A

1673-2197(2015)08-0022-02

10.11954/ytctyy.201508011